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1、实验一双向免疫扩散试验一、实验目的1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术二、实验原理 在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫扩散法就是使 抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子 量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的 沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通 过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各 有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因
2、为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且 孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗 原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂 糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此 是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个 小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相 遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀 可在琼脂中呈现一条不透明的
3、白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此 可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。三、实验仪器和试剂1、仪器设备 载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器2、试剂和材料（1）生理盐水（2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g琼脂糖，加lOOmL生理盐水，加热溶解（3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG免疫血清四、实验步骤1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室 温自然冷却凝固。2、打孔:在凝固的琼 脂糖胶上用 打孔器或吸 嘴按图1打 梅花孔（孔径 约3mm，孔距 4mm），用针6
4、O2OLO+O26标记開i琼舫轄胶的梅花扎及标记头小心挑去琼脂。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘打上小孔或切角 标记。打孔完毕，将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。3、稀释免疫血清：取5支0.5mL的离心管，各加入10uL生理盐水。如图2所示，取10uL免疫血清加入1号管中，吸打使其与生理盐水混匀，即为1： 2稀释血清；再从1号管吸取1： 2稀释血清10UL加入2号管中，吸打混匀，即为1：4稀释血清；重复操作,获得1：8、1：16和1：32倍比稀释血清。图 2 倍比稀释免疫血清4、加样：以上方孔为第1 孔，按顺时针方向分别称为2 、 3 、 4 、 5 和6 孔。抗原
5、加入 中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1 孔加生理盐水，以作空白对照，每孔加样 10 u L。5、温育：将琼脂糖胶置于湿盒（饭盒垫上纱布，加蒸馏水润湿）中，37C温育12-24 ho6、结果观察：观察抗原抗体产生的白色沉淀线。免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出 现白色沉淀线的最高稀释度来表示。五、注意事项1、制备琼脂玻片时，用移液管向玻片加上琼脂时，要一次性迅速完成，防止形成气泡 或在移液管中凝固，影响操作或结果。2、打孔时，其他六个孔要尽量围着中间孔呈圆形均匀分布。 2、注意记录琼脂糖胶的标记和加样顺序。六、结果分析 试验结果如右图所示:从 图中我们可以看到一条白 色沉淀线，说明以人IgG 与羊抗人IgG免疫血清相 关，在琼脂糖凝胶中自由 扩散而相遇，从而形成抗 原抗体复合物。而这条线 沿着各孔边缘弯曲，且随 着血清浓度从第一孔到第 五孔递减，第六孔为生理 盐水，其颜色从第一孔到 第五孔逐渐变浅，到第六 孔消失。这符合试验原理， 证明试验操作成功。I七、问题讨论1、为什么将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液？ 答：因为加温可以使琼脂溶解，封闭住打孔可能产生的细小裂痕，以免试剂随裂痕漏出影响 实验结果判定
