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1、实验一 细菌淀粉酶和过氧化氢酶定性测定一、实验目的 了解过氧化氢酶试验的反应原理和用途。了解淀粉酶试验的反应原理和用途。通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识。二、实验原理酶是微生物机体内生物合成的一种生物催化剂，它是高分子蛋白质，具有催化生物化学反应加速进行，并具有传递电子、原子和化学基团的作用。微生物的酶按它所在细胞的部位分为胞外酶、胞内酶及表面酶。本实验对胞外酶中的两种即淀粉酶和过氧化氢酶(亦叫接触酶)进行定性测定。细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的糊精，并进一步转化为糖，淀粉被酶催化分解后用碘检测不到其变色现象；过氧化氢酶能将过氧化氢快速分解为水
2、和氧气，能用肉眼很容易的观测到产生的气泡。三、实验仪器和试剂试管(15mm-150mm)5支、试管架1个、培养皿(90mm)3套、接种环。肉膏胨淀粉琼脂培养基(1L) : 蛋白胨 10g、Nacl 5g、牛肉膏 5g、 可溶性淀粉 2g、 琼脂 15g、 蒸馏水定容到1000ml 121 灭菌20min。4淀粉溶液1滴瓶:4g可溶性淀粉加水至100ml革氏碘液1滴瓶:碘1g、KI 2g、蒸馏水300ml （将I与KI先行混合，加入蒸馏水少许充 分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。9过氧化氢1滴瓶：30过氧化氢 30ml 蒸馏水 70ml枯草杆菌和大肠杆菌斜面各一支。活性污泥四、实验方
3、法(一)生活污水活性污泥混合液中淀粉酶的测定取3支干净的试管，按1、2、3对照编号。放在试管架上备用。在1号、2号试管内分别加入 5ml、10ml的活性污泥混合液，再在1号和2号试管中分别加10 ml和5 ml蒸馏水。在对照管内加15 ml蒸馏水。在1号、2号、3号及对照管中分别加入4的淀粉液4滴(淀粉液的用量，在做预备实验时根据样品中淀粉酶含量多少而定)，迅速摇匀并记下反应的初始时间。在上述3个管内分别加4滴碘液(碘液用量在预备实验时酌定)，迅速摇匀，这时各管均呈蓝色。观察结果。注意各管的变化，记下各管蓝色完全消失时的时间(即淀粉酶和淀粉反应完全的时间)，并对结果进行分析。(二)细菌淀粉酶在
4、固体培养基中的扩散实验将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化，待冷至45左右倒入无菌培养皿内(每皿约10 ml)，共倒3个，静置待冷凝即成平板。在无菌操作条件下，用接种环分别挑取枯草杆菌、大肠杆菌和活性污泥各一环分别在3个平板上点种5个点。倒置于37恒温箱内过夜培养。观察结果，取出碘液，分别在3个平板内菌落周围滴加20ul碘液，观察菌落周围颜色的变化。若在菌落周围有一个无色的透明圈，说明该细菌产生淀粉酶并扩散到基质中去。若菌落周围仍为蓝色，说明该细菌不产生淀粉酶。(三)过氧化氢酶的定性测定将配备的斜面培养基接种枯草杆菌、大肠杆菌37恒温箱内过夜培养。用滴管吸取过氧化氢滴加入到菌落上，观察菌落是否有气泡
5、。五、实验报告把所观察到的现象记录下来，进行分析。六、思考题淀粉酶定性测定中对照应呈什么颜色?为什么?各菌落呈什么颜色?为什么? 各菌落滴加过氧化氢后呈什么现象?说明什么问题?实验二 处理生活污水的活性污泥微生物总DNA的提取一、 实验目的：掌握环境样品DNA提取技术。掌握琼脂糖电泳的检测原理和方法。二、 实验原理：活性污泥是一种以好氧性细菌为主体的微生物和水中的悬浮物质、胶体物质混杂在一起形成的肉眼可见的絮状颗粒，它是废水生物处理过程的主体。环境样品的微生物总DNA的提取和纯化方法主要由两部分组成：1.温和裂解细胞及溶解DNA的技术，包括物理、化学或酶解作用裂解细胞，是DNA释放出来。2.在
6、环境样品DNA得到充分释放后，通常采用几种化学和酶学方法中的任一种来去除杂蛋白、RNA及其他的大分子。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA分子分离，把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光，EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物。三、 实验仪
7、器和试剂：仪器：核酸电泳系统，凝胶成像分析系统，离心机，移液器，水浴锅，涡旋振荡器，EP管。试剂：1、0.1%磷酸钠缓冲液（PH 8.0）100ml ：1M Na2HPO4 93.2ml、1M NaH2PO4 6.8 ml，加热配制。2、溶菌酶。3、20% SDS 100ml：20g SDS 加灭菌水定容至100ml，加热。4、70%乙醇：70ml无水乙醇，加灭菌水30ml。5、TE缓冲液（PH 8.0）：1M Tris-cl 500ul， 0.2M EDTA 250ul，灭菌水49250ul6、异丙醇，7、8mol/LKAc溶液：392.56g KAC 加灭菌水500ml，121灭菌20mi
8、n。8、1kb DNA分子量标准。9、1%琼脂糖：0.5g 琼脂糖加5ml 10TBE，45ml水。10、10TBE： Tris-base 54g、Boric Acid 27.5g、Na2EDTA 4.65g 加蒸馏水定容至500ml，用HCL调PH 8.311、核酸上样缓冲液：10ladder四、 实验方法：1、 取1g活性污泥，离心12000rpm 3min 去上清，灭菌水洗涤2次，10000rpm 3min,去上清。加1ml 0.1mol/L PH8磷酸钠缓冲液,漩涡震荡器震荡20min。2、 加溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml，振荡5min,37水浴30min。3、 加120u
9、l20%SDS轻柔振荡15min，6000rpm离心10min。4、 取上清液加0.2倍体积冰冷的8MKAc，颠倒混匀1min，12000rpm离心10min。5、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀1min，室温下放置10min，12000rpm离心10min。6、 去上清，加1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀，12000rpm离心2min，去乙醇后于37干燥 10min。7、 重复做第6步8、 每管加100 ul TE+400ul灭菌水+0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。9、 弃上清液，将沉淀定容于200
10、ulTE缓冲液中，加0.2倍体积8M KAC，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm离心10min。10、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。11、 弃上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀、12000rpm离心10min，干燥，溶于200 ul TE缓冲液中。12、 吸取20ul DNA溶液，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA提取效果。加上1kbMaker作为DNA大小的标准。五、实验报告把在1%琼脂糖凝胶观察到的现象记录下来，进行分析。六、思考题SDS和乙酸钾的作用? 不同浓度的琼脂糖凝胶电泳的分辨率?实验三 微生物总DNA中的16SrDNA PCR扩增技术一、 实验目的了解以通过引物进行16SrDNA PCR扩增的基本原理掌握从活性污泥微生物总DNA中进行16SrDNA PCR扩增的方法二、 实验原理RCR是一种选择性
