凯氏定氮法实验报告

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1、凯氏定氮法实验总结题目：蛋白质浓度测定（微量凯氏定氮法）姓名：穆拉地力地力夏提学号：074031141一、【实验目的】1. 掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法2. 学会使用凯氏定氮仪并学会用凯氏定氮仪测出小油馕中的蛋白质含量二、【实验原理】凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化 还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的 消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸 钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物 分解，硫酸铜起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有

2、 机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化 钠，将NH4+转变成NH3,通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接 受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子 浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数,通过计算即可得出总氮量。 在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测 定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。以甘氨酸为例，其反 应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4 =2C02+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3 +H2SO4 = （NH4）2SO4（NH4）2SO4

3、+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH（3）反应（1），（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）凯氏蒸馏烧瓶中进行（图1）。 蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在 14 18，平均为16）。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋 白质含量。三、【试验器材】1. 凯氏定氮仪2. 电炉3. 消化架4. 锥形瓶 100ml （X5）5. 量筒 10ml（X 1）6. 滴定管（5ml,可读至0.02ml）7. 凯氏烧瓶（X2）8. 玻璃珠9. 吸耳球10移液管（2ml, 5ml, 10mlX1）四、【实验试剂】1. 浓硫酸（AR）2. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫

4、酸钾3 份与硫酸铜1 份混合研磨成粉末。3. 40%氢氧化钠溶液：30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。4. 2%硼酸溶液：2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至100ml。5. 混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液和0.1%甲烯蓝乙醇溶液按体积比4:1混合。6. 0.00963mol/L 标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释标定。五、【实验操作】1样品的消化将两个 50mL 的凯氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加 1.0mL 蒸馏水，作为空白。另一只烧瓶内加入1.0mL样液。然后用取样器各加浓硫酸 4mL （取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸 钾一硫酸铜混合物约2

5、00mg （不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到凯 氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上 加热消化，注意先启动抽风机在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。 待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化， 直至消化液呈透明蓝绿色为止。消化时间为23h，冷却，准备蒸馏。在消化时 可以同时进行第二步。2定氮仪的洗涤凯氏微量定氮蒸馏装置1.电炉 2.蒸汽发生烧瓶 3.玻璃管 4.橡皮管 6.反应室 7.玻璃杯8.气水分离器 9.冷凝管10.锥形瓶11.棒状玻璃塞12.废液排出管仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。蒸气发生器中装加

6、有h2so4的蒸馏水和数粒沸石，加甲基橙指示剂后显粉红 色。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受锥形瓶 瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤 5 分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。 将一只盛有5mL 2%硼酸液和12滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使 冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏3分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。 若硼酸的颜色变为淡绿色，说明定氮仪内有残留氨，需要进一步用蒸汽洗涤。若 反应室内有上次操作剩余的残夜，可以通过图 1 中 7 向反应式加冷的蒸馏水，然 后短时间关闭 4，则残夜会倒吸回贮液管，重复几次，并用蒸汽洗涤几分钟，再 用上述方法检验是否已经

7、洗干净。打开 12废液排出管的夹子可以将废液放出。3标准品练习（标准硫酸铵溶液，含氮量 0.3mg/ml）仪器洗好后，取一 100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻 璃管插入硼酸溶液中。取下11 （图1）棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应 室加入2ml硫酸铵溶液，然后将玻璃塞放回，向7 （图1）玻璃杯中加入 10ml30%NaOH溶液，旋转棒状玻璃塞，将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中， 并留少量液体作水封。等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计 时，继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。 并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形

8、瓶。立即用标准盐酸溶液进行滴定， 如果用滴定结果计算出的标准硫酸铵中氮含量接近于0.3mg/ml。则说明整个实 验操作正确，可以进行下一步。4样品测定仪器洗好后，取一 100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻 璃管插入硼酸溶液中。取下11棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入 2ml消化好的样品溶液，然后将玻璃塞放回，向7玻璃杯中加入10ml30%NaOH 溶液，旋转棒状玻璃塞，将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中，并留少量液体作 水封。等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时，继续蒸馏3min, 然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。并用少量蒸

9、馏水 洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶。立即用标准盐酸溶液进行滴定，按上述方法洗涤 仪器准备下一次蒸馏。重复蒸馏并滴定三次。将2ml消化好的样品溶液改为2ml消化后的空白对照溶液，其他操作同上， 测量三组。三组空白测量中，若锥形瓶中的硼酸溶液不变色，则无需滴定。六、【注意事项】 1凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组 复杂样品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。其缺点是操作比较复杂， 含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。2普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁 净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。3定氮仪各连接处应使玻璃

10、对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。蒸馏时需控制火 力以避免样液倒吸。4消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫 喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡 沫产生。5消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。 若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后， 再继续加热消化至完全。6蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫 酸铜作用。若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀。 所以，加入的氢氧化 钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。7蒸气发生瓶

11、内的水装至 2/3 体积并且保持酸性（在蒸气发生瓶内的水中加入 稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该 补加酸），以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。8因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力，而反应室的压力大于大气 压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸气要均匀、充足，蒸馏中不得停火断气， 否则，会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒 吸入反应室外层，所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸 1min 后关掉热源。C(A-B)X 14.008X4V七、【实验结果】123平均标准品练习4.40空白10.090.13

12、0.110.11样品32.752.922.862.841结果表一各组实验消耗的标准盐酸体积（ml）2计算式中m：样品中的含氮的质量，即4ml样品中含氮量（mg） A：滴定样品消耗的HCl溶液体积（ml）B：滴定空白消耗的HCl溶液体积（ml） V：相当于未稀释样品的体积（ml） c：盐酸物质的量浓度（m ol/L） 14.008：每摩尔氮原子质量（g/mol） 4： 4ml 样品所以可得：1.标准硫酸铵中的N含量：m =0.00963 X 4.40 X 14.008X42=0.297mg该结果与标准值的相对误差=（0.2970.3） /0.3X100 =1，这表示我 们整个的实验操作正确。2

13、.蛋清中 N 含量（100ml 样品）：m = 0.00963X（2.84011）X14008X1002 =18.41 mg3若样品中含氮物均为蛋白质，则蛋清样品中蛋白质的含量为：18.41X6.25 = 115.063 mg八、【结果分析及讨论】1分析：1. 在测量标准硫酸铵中含氮量时，我们测得的结果为0.297mg/ml，而标准 值为0.3mg/ml,相对误差为1%,这说明我们组的实验仪器状态良好，而且操作也 是正确规范的。2. 在测定样品中氮含量时，我们的测定结果为18.41mg N /ml,而且三组测 量数据的相对偏差分别为2.55%， 2.23%， 0.76%，可见相互之间偏差很小，

14、即实 验准确性较高。由此推出实验室提供样品含氮量也应该在 18.41mg N/ml 左右。2讨论：本实验定氮的目的是确定样品中蛋白的含量，使用凯氏定氮法测定蛋白含量 具有许多优点。该方法可用于食品的蛋白质分析，操作相对比较简单，实验仪器 和实验试剂相对比较便宜，并且结果准确，是一种测定蛋白质含量的经典方法。 但本方法最大的缺点在于最终测定的是总氮，而不仅仅是蛋白质氮，并且实验的 时间太长，关于这一点在本次实验中深有体会。除了凯氏定氮法，测量蛋白含量 常用的方法还有双缩尿法、Folin 酚试剂法和紫外吸收法。其中Folin 酚试 剂法在先前的实验中已经做过，这种方法灵敏度高并且操作简便、快速，但准确 度相对不高，且有的检测不可用。每一种方法都有其优点与不足，方法的选择要 由实际情况来定。