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1、生化分析仪常用分析方法共有三大类，分别为终点法、固定时间法和动力学法。终点法： 指经过一段时间的反应，反应达到平衡，由于反应的平衡常数很大，可认为全部 底物（被测物）转变成产物，反应液的吸光度不再变化，只与被测物的浓度有关。这类方法 通常称为“终点”法，更确切地说应称“平衡”法。单试剂单波长终点法：tl时刻加入试剂（体积为V）, t2刻加入样本（体积为S）,然后搅拌并反应，之后开始测量反应液的吸光度，在t3时刻反应达到终点，t3-12为测定时间。反应度R=At3-At2-1XV/(V+S)，或R=At3ARBLK。其中：Ati为i时刻的吸光度，ARBLK为试剂空白吸光度。单试剂双波长终点法：
2、基本上同“单试剂单波长终点法”，只是对于每一个测定周期，其 实际吸光度等于A入1A入2。双 试 剂 单 波 长 终 点 法 ： t1 时 刻 加 入 第 一 试 剂 （ 体 积 为 V1） ， t2 时 刻 加 入样 本 （ 体 积 为 S） 之 后 立 即 搅 拌 ， t3 时 刻 加 入 第 二 试 剂 （ 体 积 为 V2）并立即搅拌，t4时刻反应达到终点。13-12为孵育时间，t4-t3为测定 时间。在项目参数中，如果反应起始时间设为 0,则反应度R=A时刻吸光度-双试剂空白吸光 度。如果反应起始时间小于0,贝V反应度R=At4 -双试剂空白吸光度-13到t2间设定点的吸光度X（V1+
3、S） /（V1+S+V2）。双试剂双波长终点法： 基本上同“双试剂单波长终点法”，只是对于每一个测定周期，其 实际吸光度等于A入1A入2。固定时间法：又称为一级动力学法、二点动力学法等，指在一定的反应时间内，反应速度 与底物浓度的一次方成正比，即v=kS。由于底物在不断的消耗，因此整个反应速度在不 断的减小，表现为吸光度的变化越来越小。这类反应达到平衡的时间很长，理论上可以在 任意时间段进行监测，但由于血清成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，必 需经过一段延迟时间才能进入稳定反应期。11时刻加入试剂（体积为V），之后测量试剂空白的吸光度，12时刻加入样本（体积为S），13 时刻反应稳
4、定，14时刻停止对反应进行监测；12 13为延迟时间，13 14为测定时 间。单波长反应度（单双试剂相同）：R=At4At3双波长反 应度：R= （t4时刻主波长吸光度一t4时刻次波长吸光度）-一（t3时刻主波长吸光度一t3时 刻次波长吸光度）动力学法：又称零级动力学法，指反应速度与底物浓度的零次方成正比，也就是与底物浓 度无关。因此，在整个反应过程中，反应物可以匀速地生成某个产物，导致被测定溶液在 某一波长下吸光度均匀地减小或增加，减小或增加的速度（AA/min）与被测物的活性或浓度 成正比。动力学法也被称为连续监测法；主要用于酶活性的测定。实际上，由于底物浓度不可能足够大，随着反应的进行，
5、底物消耗到一定程度后， 反应速度不再为零级，因此，零级动力学法是针对于特定时间段而言的；同样，由于血清 成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，必需经过一段延迟时间才能进入稳定 反应期，各试剂商对这两段时间有严格规定。tl时刻加入试剂（体积为V）, t2时刻加入样本（体积为S）, t3时刻反应稳定，tn时刻停止对 反应进行监测；t3-t2为延迟时间，tn-t3为测定时间。单波长反应度（单双试剂相同）R= （nEAT-EAET） / ：nET2-（ET） 2，其中：n = t3到tn间的数据个数,T =时间,A二某一时间的吸光度。双波长反应度基本同单波长，只是某一时间的吸光度等于主波长吸
6、光度减去次波长吸光度。第二章生化自动化分析方法概要一、分析方法分类（一）终点法被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小 求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与 产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看， 到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个 吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终 点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。终点时间的确定：根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder
7、反应测定尿酸，反应曲线上3 5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。根据被测物反应终点，结合 干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s 内很快完成反应，之后a球蛋白和B球蛋白与溴甲酚绿发生慢反应，使反应曲线上吸光 度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用1030s，而不应选择 10min。1一点终点法：在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终 点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3。 其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=
8、（待测吸光度AU 试剂空白吸光度AB）XKO K 为校准系数，详见第五节二操作方法。2两点终点法 ：在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达 终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two poin tend essay），其反应曲线见图7-4。计算公式为CU=（待测吸光度A2 待测吸光度A1） XKO该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等 样品本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中 第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可
9、在此时选择第一个吸光度，在 指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明 显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析 项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期 吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果 将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终 点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均 具有此自动校正功能，不必手工进行校正。（二）固定时间法 指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点
10、，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这 两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图 7-6。其计算公式与两点终点法相同，为CU=（A2-Al）XK。有时也称此法为两点法。该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初 30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在 第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间一吸光度曲线的线性较好（故也可用 连续监测法测定肌酐）；在80120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰 物反应。这样选用反应的第二个30s为测定
11、时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢 反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性 和准确度。（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活 性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性 期的单位吸光度变化值（AA/min）计算结果，见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度 差值相等，如图7-7C所示，图中6 1及65值偏小，而5 2= 5 3= 5 4，故A1点至A4点属线性 段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的AA/min即
12、为酶促反应的初速度，其大小与被 测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算AA/min，根据此值再准确 地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法 也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L） = AA/minX理论（或校准）K值，代谢物浓度CU二AA/minX校准K值。关于理论K值和校准K 值叙述如下：1. 理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶 活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性（U/L） = AA/minX，将此式中以K 来表示，此K值可通过对已知值即指
13、示物质的毫摩尔消光系数（）、反应液总容量（TV）、 样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分 析仪中。采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波 长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差 异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。温度的影响有时也非常大，由于反应 盘是半暴露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测定时 反应盘温度已升到37C,但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37C，甚 至仅35C左右，且反应过程中仍有可能上下波动，这对于
14、酶学反应来说影响是很大的。如 采用37C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。 当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度。由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或 试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实 际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值。(1) NADH (NADPH)摩尔吸光系数的测定：NADH (NADPH)没有标准纯制品，而且配成溶液 后稳定性又较差，不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与
15、 的反应途径。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与 NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液。因 此，根据公式A=ebC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度 A后便可计算出NADH (NADPH)的摩尔吸光系数为A/bC。假设，葡萄糖标准液浓度为 10mmol/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5口L，酶试剂加入量为335 口L，比色杯光径为 0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数=6424 ，即在此台分析 仪上340nm波长处测得NADH (NAD
16、PH)的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH (NADPH)的 为6220。(2) 色素原酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的色 素原底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。 最常用色素原底物及其产物为：ALP测定以磷酸对硝基苯酚(4-Nitrophenyl phosphate， 4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol, 4-NP)，GGT测定以 丫-L-谷氨酰对硝基苯胺(Y -L-Glu tamyl-p-ni troa nil ide)或Y -L-谷氨酰-3-羟基-对硝基 苯胺(Y -L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯 胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5
