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1、业技术学院毕业论文（设计）毕 业 论 文（设计）题 目 茶叶提取物抗补体活性初步研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010年 5 月 30 日III摘要 在8种植物提取物中筛选出一种有较好抗补体活性成分植物（茶叶），然后再对该植物进行活性成分浓度与抗补体活性效果关系研究，以便为茶多酚新用途提供参考。研究主要利用超声波对植物抗补体活性成分提取制备，再运用抗补体溶血活性检测方法筛选与检测具有抗补体活性成分植物和抗补体活性效果；研究结果表明，8种植物中杭白菊和绿茶具有较好的抗补体活性成分，粗提物溶血活性CH50检测值分别为0.152、0.535mg/mL，对茶多酚分离
2、提纯后三个成分98%茶多酚（EGCG为45%）、EGCG及咖啡碱的溶血活性CH50检测值分别为0.353、0.451mg/mL，咖啡碱没有抗补体活性效果；由此可以初步得出茶多酚为较好的抗补体活性成分，但抗补体活性效果的主导成分不是EGCG，而且粗提物抗补体活性更好。关键词：茶多酚；抗补体活性；溶血活性检测；茶叶；清热解毒目 录引言.11材料.21.1实验材料.21.2实验试剂.21.3实验仪器.22方法.22.1八种植物提取物制备.22.2茶叶抗补体活性成分分离.22.3补体经典途径的溶血活性(CH50)测定.22.3.1溶液配制.32.3.2补体制备及效价测定.32.3.3药物经典途径抗补体
3、活性测定. 33.结果与分析.33.1八种植物提取效果的比较.43.2八种植物抗补体初步筛选.43.3茶叶抗补体活性测定结果.44. 结果与讨论.5参考文献.7II业技术学院毕业论文（设计）1引言业技术学院毕业论文（设计）补体系统是人体重要的免疫防御系统之一。补体系统的正常激活在消灭外来微生物、清除肌体内损伤或死亡的细胞和组织以及维持机体的平衡中起着重要的作用。与补体激活相关的疾病如心肌死、肾炎、系统性红斑狼疮、SARS等，均是发病群体数量巨大、危害性强的疾病。目前临床上广泛使用的糖皮质激素等免疫抑制剂虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药并非专一的补体抑制剂，选择性差
4、，长期应用会降低机体的防御机能，产生多种副作用和并发症。因此临床上急需高效低毒专一的新型补体抑制剂。国内外已完成部分天然产物的筛选，发现自然界中广泛存在的某些多糖、黄酮、甾类扫萜类化合物具有显著的抗补体活性。本文将对几种天然产物类抗补体活性成分的测定1。自然界中广泛存在具有抗补体作用的活性成分，直接从植物中研究开发天然补体抑制成分的成本低，且大多数活性成分作为药用植物的一部分可以直接被机体消化吸收，因此天然产物中高教低毒的新型补体抑制剂的研究与开发受到国内外学着的广泛关注。 茶叶中含有大量的茶多酚，茶多酚是茶叶中具有生物活性的重要成分之一，是一类存在于茶叶中的多羟基酚性化合物的混合物。研究表明
5、，茶多酚不仅是一种天然的无毒抗氧化剂，也是一种理想的天然药物，具有多种保健功能和药理作用，可以清除自由基，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗紫外线照射、防治心血管病、除臭、延缓衰老、抗龋护齿、抗肿瘤、多药耐药性逆转和抗辐射等作用。杭白菊为“浙八味”之一。其作为一常用药具有疏风清热、平肝明目的功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花。现代药理学研究证明，杭白菊主要含有黄酮类化合物、挥发油、绿原酸、维生素等成分，其中杭白菊总黄酮2。豆腐柴具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等功能清热解毒、消肿止血等功效，民间常用来治疗蛇毒咬伤、无名肿毒、创伤出血等。不仅仅是以上这几种植物，从文献中得知麦冬、
6、温郁金、这些“浙八味”还有芦荟、鸭趾草、艾草等植物，均具有清凉解毒，抗自由基等作用。1材料1.1实验材料麦冬、温郁金、鸭趾草，购于杭州新城医院；杭白菊、绿茶、芦荟，购于下沙物美超市；豚鼠，新西兰兔，上海复旦大学实验动物部提供：1.2实验试剂BBS、2%SRBC、巴比妥、溶血素、30%的酒精。1.3实验仪器微波提取器（NJL07-3，实验室专用微波炉）；低温高速离心机(Jonan MR22i型， JOUAN公司，法国)；酶标仪(Well scan MK3，Thermo labsystems公司，芬兰)；恒温振荡器(WMZK 8002，上海医用仪器厂)；冷冻干燥器(Freezedryerl8型，L
7、abconco公司，美国；2方法2.1八种植物提取物制备3称取绿茶250g用微波真空提取（80-90，时间:30min，料液比1:10）提取两次合并滤液抽滤用旋转蒸发仪浓缩成膏状放到干净的铝盒真空干燥。豆腐柴、麦冬、温郁金、杭白菊、芦荟、艾草、鸭趾草，7种提取方法同绿茶提取方法相同。2.2 茶叶抗补体活性成分分离4称取绿茶500克30%酒精超声提取两次，每次30分钟过滤离心孔径0.45m微孔滤膜过滤截留分子量5000及1000超滤膜过滤浓缩大孔树脂吸附不用浓度的酒精溶液洗脱浓缩、冻干茶多酚固体检测。2.3 补体经典途径的溶血活性(CH50)测定2.3.1溶液配制5,6 巴比妥缓冲液配制：先配制
8、出5倍浓缩巴比妥缓冲液(5BBS)。使用时稀释成巴比妥缓冲液(BBS)。2羊红细胞(SRBC)配制：取绵羊血2mL，用BBS洗涤，800r/min，离心3min，重复3次后，再3000r/min。离心10min压积，然后用BBS配成2%SRBC。1:1000溶血素配制：用BBS配制成1:1000溶血素溶液。绿茶溶液配制：称取茶多酚4mg，用BBS超声溶解成1:1溶液(5mg/mL)，加BBS对倍稀释配成1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128共8个浓度的供试品溶液。2.3.2补体制备及效价测定7,9豚鼠股动脉取血约10mL，4放置1h凝固后，800r/min，离心5mi
9、n，取血清，加入以BBS洗涤后的2%SRBC约2mL，混匀后，800r/min，离心5min，取上清液作为补体分装，-70冷冻保存备用。补体经典溶血系统的建立：取补体(豚鼠血清)0.1mL，加入BBS配制成1:10溶液，用BBS对倍稀释成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280溶液。取1:1000溶血素、各浓度补体及2%SRBC各0.1mL溶于0.3mLBBS中，混匀，37水浴30min后，在5000r/min，4条件下离心10min分别取上清0.2mL ，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1mL2%SRBC溶于0.5mL三蒸水中)。以三蒸
10、水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X 轴，溶血百分率为Y轴作图。选择达到高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。2.3.3药物经典途径抗补体活性测定10,11 取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，按照表1加入适量BBS、溶血素和2 % SRBC。37水浴30min 后，5000r/min，4条件下离心10min后分别取每管上清液0.2mL，用酶标仪在405nm下测定吸光度。实验同时设置8种提取物对照组，补体组和全溶血组。3. 结果与分析3.1八种植物提取效果比较 通过八种植物的提取过程中发现有的提取物很粘（如温郁金）不容易过滤，有的干燥后的质量不
11、是大，在对比之下要选着，容易过滤，干燥后质量较大的。提取物干燥后的质量比较如表3.1。表3.1 八种植物提取物干燥后的质量比较植物名称铝盒重量（g）干燥后铝盒重量（g）提取物质量（g） 豆腐柴37.853044.31296.4599麦冬46.311551.69575.3842温郁金46.238057.784611.5466杭白菊16.551722.40485.8531芦荟34.879235.09041.7888绿茶34.302038.02293.7209艾草37.69840.12382.4258鸭趾草33.848235.98392.1357对比表格中得出温郁金、豆腐柴、麦冬、绿茶的提取物重量较
12、大，但是考虑到温郁金、豆腐柴、麦冬这三种浓缩液较粘，不易过滤。3.2八种植物抗补体活性初步筛选 在八种植物提取物的提取和干燥后，然后再对这几种植物提取物进行抗补体活性进行分析，惊奇的发现只有绿茶和杭白菊具有抗补体活性，但是茶多酚的抗补体活性为0.152mg/mL，杭白菊的抗补体活性为0.535mg/mL，相比之下茶多酚的活性较为理想。3.3茶叶抗补体活性的测定结果在对绿茶提取进行分离检测后得到：茶多酚含量为98%，EGCG含量为45%。试验的同时把粗提取的茶多酚和纯的EGCG还有咖啡碱也进行了抗体活性的检测。结果如表3.2、3.3、3.4。表3.2茶多酚经典途经溶血实验中所加各成分的体积(mL)分组BBS三蒸水补体茶多酚溶血素2%SRBC茶多酚测定0.2- 0.10.3530.10.1茶多酚对照0.5-补体组 0.3- 0.1-0.10.1全溶血组-0.5-0.1表3.3EGCG经典途经溶血实验中所
