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1、实验三PCR扩增制备目的基因概念反转录是以 RNA 为模板,通过反转录酶,合成 DNA 的过程， 是 DNA 生物合成的一种特殊方式。区分:反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之为模板 人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合 到宿主细胞内以 RNA 为模板形成 DNA 的过程。二者虽同为 RNADNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外， 逆转录在体内。2 反转录酶与反转录过程反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚 合酶(RDDP)，即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的 DNA链称为
2、与RNA互补DNA (cDNA)。反转录酶存在于一些 RNA 病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒 (HIV)也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常 细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发 育有关。大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA 的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物 tRNA3一末端以53方向合成DNA。反转录酶中不具有35 外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的 DNA出错率比较高。 RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA
3、与模板RNA 形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5端水解掉RNA分子。 DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条 DNA 单链为模板，以 dNTP 为底物，再合成第二条 DNA 分子。除此之外，有些反转录酶还有 DNA 内切酶活性，这可能与 病毒基因整合到宿主细胞染色体 DNA 中有关。反转录酶的发现 对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要 的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的 作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库 (cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术 中最常用的获得目的基
4、因的方法。反转录的简要过程表示如下：反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，RNA(主 要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3OH末端上，按53方向， 合成一条与 RNA 模板互补的 DNA 单链，这条 DNA 单链叫做互 补 DNA(complementary DNA, cDNA)， 它与 RNA 模板形成 RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下,水解掉RNA链， 再以 cDNA 为模板合成第二条 DNA 链。至此，完成由 RNA 指 导的 DNA 合成过程。3 生物学意义反转录的发现有重要的理论意义和实践意义。（1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后 的中心法
5、则表示为:是指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA 传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从 DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结 构的生物所遵循的法则。某些病毒中的RNA自我复制（如烟草 花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的 过程（某些致癌病毒）。有些病毒（如阮病毒,即疯牛病病毒）以 蛋白质直接形成蛋白质。（2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因,在人类一些癌细 胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中,也分离出与病毒癌基因相同 的碱基序列,称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤 发病机理的研究提供了很有前途的线索。（3）在实际工作中
6、有助于基因工程的实施。由于目的基因 的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得 目的基因。RNA反转为cDNA10川体系mix 2RNA 500ngAdd Oto 10H2PCR 程序37 Co10min85C5s稀释产物即可用于后续实验。实验三PCR扩增制备目的基因1目的学会PCR操作的基本技术。2原理是将待扩增的 DNA 模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核 苷酸引物复性，然后经过耐热的 DNA 聚合酶延伸。再进入下一 轮变性一复性一延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增(1+X) n倍。其中25nt的引物退火温度T m=2 (A+T) +4 (G+C)。3器材旋涡混合器，微量
7、移液取样器，移液器吸头， 0.2ml PCR 微 量管，双面微量离心管架， PCR 仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电 泳系统，水漂，恒温水浴。4试剂3U/yl Taq DNA 聚合酶，PCR 缓冲液（10x, MgCI2 free）, 25mM MgCl2, dNTP，引物，模板质粒 pMD18-T-NK,无菌 dd water。5实验准备dNTP 混合液（每种 25mM）， TAE 电泳缓冲液， 1000 溴化 乙锭储存液（0.5mg/ml）,10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液 器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）合成的引物：Sense primer Antisense pri
8、mer目的基因 模板质粒待扩增的NK片段长度6操作步骤（1）在0.2ml PCR微量离心管中配制20口反应体系。（以 下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说 明书计算）dd wate r 13.9|aL10xPCR buffer （含 MgCI2） 2|aL2.5mmol/L dNTP 2LPr ime r1 0.5|aLpr ime r2 0.5|aL模板质粒1yL3U/|al Taq 酶 0.1|aL (3u)总体积20yL( 2 )根据厂商的操作手册设置 PCR 仪的循环程序：94C3min 94C30sec 55C30sec 72C1mingot o35 times 72C10min(3) PCR结束后，取10yL产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察 胶上是否有预计的主要产物带。( 4)清理桌面，撰写实验报告。(5)PCR产物可以直接与T载体连接，然后转化感受态细 胞。7思考(1)复性温度如何确定？(2)为什么要在最后延伸 10min？( 3)是否有非特异性扩增产物(或引物二聚体)，如何才能消除？
