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1、预习要求：1、思考题无论正确与否，需全部作答；最后一道思考题要写原因。2、预习报告中要包含实验原理，仪器试剂，实验步骤，记录表格。3、查阅毛细管电泳四种待分析物（苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯甲酸）的pKa值, 并标明所查文献或网址。4.3毛细管电泳法4.3.1 原理1808年俄国物理学家Von Reuss首次发现电泳现象，即溶液中的荷电粒子在电场作用下 会因为受到排斥或吸引力而发生差速迁移。1937年瑞典科学家Arene Tiselius成功地把电泳 技术用于人血清中不同蛋白质的分离，因此而获得了1948年诺贝尔化学奖。在传统电泳中 凝胶可以抑制因热效应而导致的对流，但如果在自由溶液中施加
2、高的电压，就会导致大的焦 耳热,严重影响分离。因此，人们一直致力于减小分离介质的尺寸。1981年美国学者Jorgenson 和Lukacs使用内径为75 pm的熔融石英毛细管，配合30 kV的高电压进行自由溶液电泳， 获得了高于40万理论塔板数的分离柱效。这标志着毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE） 作为一种新型分离分析技术的诞生。经过近30年的发展，CE现已广泛应用于无机离子、中 性分子、药物、多肽、蛋白质、DNA及糖等各类化合物的分析，并被认为是20世纪分析化 学领域中最有影响的进展之一。20世纪90年代后期出现的阵列CE技术作为基因测序的关 键方法在人
3、类基因组计划中发挥了极其重要的作用。CE的的分离原理如图4.6所示。在毛细管中充满缓冲液，将其两端置于缓冲溶液瓶中， 当样品被引入毛细管后，在毛细管两端施加直流电压，此时，电渗流带动整个溶液在毛细管 中流动，不同的带电粒子因其电泳淌度的不同而发生差速迁移，从而实现分离。与传统的电 泳技术相比，CE具有应用范围广、分离效率高、分离模式多、样品用量少、分析成本低、 环境友好等特点。CE 有6 种分离模式，见表4.14。毛细管区带电泳图4.6 CE仪器组成示意图（CZE ）是最简单的模式，因为毛细管中的分离介质只 是缓冲液。在电场的作用下，样品组分以不同的速率在 分立的区带内进行迁移而被分离。由于电
4、渗流的作用， 正负离子均可以实现分离。在正极进样的情况下，正离 子首先流出毛细管，负离子最后流出。中性分子由于不 带电荷，故随电渗流一起运动，故CZE模式不能分离不 同的中性化合物。MEKC和CEC则可同时分离带电的和 中性化合物。表4.14 6种CE分离模式的分离依据及应用范围分离模式分离依据应用范围毛细管区带电泳（CZE）溶质在自由溶液中的淌度差异可解离的或离子化合物、手性化合物及蛋白质、多肽等毛细管胶束电动色谱溶质在胶束与水相间分配系数 中性或强疏水性化合物、核酸、（MECC）的差异多环芳烃、结构相似的肽段毛细管凝胶电泳（CGE） 溶质分子大小与电荷/质量比差 蛋白质和核酸等生物大分子异
5、毛细管等电聚焦(CIEF) 等电点差异蛋白质、多肽毛细管等速电泳(CITP)溶质在电场梯度下的分布差异(移动界面)同 CZE，电泳分离的预浓缩毛细管电色谱(CEC)电渗流驱动的色谱分离机制同 HPLC影响CE分离的主要因素有：缓冲液的种类、浓度和pH值，缓冲液添加剂的种类和用 量，电压的方向和大小，进样方式和样品的浓度，毛细管的尺寸和温度，以及毛细管内壁的 修饰等等。4.3.2 仪器结构与操作1. 毛细管电泳仪的构成图 4.6 所示为 CE 仪器示意图。其组成部分主要是高压电源、缓冲液瓶(包括样品瓶)、 毛细管、检测器以及控制系统。高压电源是为分离提供动力的，商品化仪器的输出直流电压 一般为0
6、30 kV。大部分直流电源都配有输出极性转换装置，可以根据分离需要选择正电压 或负电压。缓冲液瓶多采用塑料(如聚丙烯)或玻璃等绝缘材料制成，容积为13mL。考 虑到分析过程中正负电极上发生的电解反应，体积大一些的缓冲液瓶有利于pH的稳定。进 样时毛细管的一端伸入样品瓶，采用压力或电动方式将样品加载到毛细管入口，然后将样品 瓶换为缓冲液瓶，接通高压电源即可开始分析。目前CE用的毛细管主要是内径为25-100 pm的熔融石英毛细管，外面涂有聚酰亚胺保 护层，长度50 cm左右。CE多用UV检测器，由于光线通过毛细管进行“柱上”检测，故没 有柱外效应的问题。当然，毛细管的检测窗口处要除去涂层，保证透
7、明。此外，CE还用电 化学检测器、激光诱导荧光检测器和质谱检测器等。2. 毛细管电泳仪的操作(1) 准备工作，包括安装毛细管、连接电源线和信号线，等等。(2) 配置缓冲溶液。根据实验要求配置适当浓度和pH值的缓冲溶液，并经0.45 pm滤膜 过滤，再超声波脱气10 min。然后分装到仪器的缓冲液瓶中，置于仪器样品盘上毛细管入 口(Inlet)的适当位置。在毛细管出口(Outlet)相应的位置放置一个空的废液瓶。(3) 配置样品溶液，并用0.45pm滤膜过滤。将样品瓶置于仪器样品盘上毛细管入口(Inlet) 的适当位置。 注：实际操作中，学生不需要完成(2)(3)步骤，直接使用已经配置好的缓冲溶
8、液即可。(4) 开启仪器电源，设置工作温度，编辑冲洗毛细管程序：建议顺序依次是： 1 mol/L NaOH 溶液冲洗3 min,二次水冲洗3 min,缓冲溶液冲洗5 min。冲洗过程中毛细管出口(outlet)对 准废液瓶的位置。然后运行该程序。程序编辑方法请参看仪器操作说明书。(5) 开启计算机和相应的工作站软件，参照操作说明书进行程序编写，待检测器基线稳定 后便可开始进样分析。(6) 编辑分析方法，按照实验要求和样品瓶位置，设置毛细管温度、进样条件、分析电压 以及检测波长。(7) 运行分析方法，工作站软件自动记录电泳图。(8) 每次进样前通常要用分析缓冲液冲洗毛细管3 min左右，以保证分
9、析的重现性。(9) 完成实验后，用纯水冲洗毛细管10 min,再用空气吹干10 min。(10) 退出色谱工作站软件，关闭计算机和仪器电源。实验 4.7 毛细管区带电泳法分离离子型化合物【目的】 进一步理解毛细管电泳的基本原理；熟悉毛细管电泳仪器的构成和操作；了解影响毛 细管电泳分离的主要操作参数。【原理】CE是以电渗流（EOF）为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分之间淌度和分 配行为上的差异而实现分离的一种液相微分离技术。离子在自由溶液中的淌度（卩）可表示 为：式中q为粒子的荷电量，耳为介质粘度，r为带电粒子的流体力学半径。因此，离子的 电泳淌度与其荷电量呈正比，与其半径及介质粘度呈
10、反比。带相反电荷的离子其电泳淌度的 方向也相反。需要指出，在物理化学手册中查到的离子淌度常数是绝对淌度，即离子带最大 电量时测定并外推至无限稀释条件下所得到的数值。在CE分离实验中测定的值往往与此不 同，故将实验值称为有效淌度（卩）。有些物质因为绝对淌度相同而难以分离，但我们可以 通过改变介质的 pH 值，使离子的荷电量发生改变。这样就可以使不同离子具有不同的有效 淌度，从而实现分离。在水溶液中多数固体表面根据材料性质的不同带有过剩的负电荷或正电荷。就石英毛细 管而言，表面的硅羟基在pH大于3以后就发生明显的解离，使表面带有负电荷。为了达到 电荷平衡，溶液中的正离子就会聚集在表面附近，从而形成
11、所谓双电层。这样，双电层与管 壁之间就会产生一个电位差，叫做Zeta电势。当毛细管两端施加一个电压时，组成扩散层 的阳离子被吸引而向负极移动。由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一 起向负极运动，这便形成了 EOF。EOF 的大小可用速率和淌度来表示：v=侥/耳）EEOF卩 二竞/耳EOF式中VEOF为电渗流速率，E为外加电场强度，lEOF为电渗淌度，为Zeta电势，耳和分别为 溶液的粘度和介电常数。可见，影响EOF大小的因素主要有电场强度、Zeta电势和缓冲液 的性质。一般来说， E 越大， pH 越高，表面硅羟基的解离程度越大，电荷密度越大，电渗 流速率就越大。 EOF 还与
12、毛细管的表面性质（硅羟基的数量、是否有涂层等）和溶液的离 子强度有关，双电层理论认为，增加离子强度可以使双电层压缩，从而降低Zeta电势，减 小EOF。温度升高可以降低介质粘度，增大EOF。由上可知，电渗流的方向与电场方向一般是一致的，即从正极到负极。但在溶液中加 入阳离子表面活性剂后，由于毛细管表面强力吸附阳离子表面活性剂的亲水端，而阳离子表 面活性剂的疏水端又会紧密结合一层表面活性剂分子，结果就形成了带正电的表面，双电层 Zeta电势的极性发生了反转，最后使电渗流的方向发生了变化。EOF 的一个重要特性是具有平面流型，其优点是径向扩散对谱带扩展的影响非常小， 这是CE具有更高分离效率的一个
13、重要原因oEOF的另一个重要优点是可以使几乎所有被分 析物向同一方向运动，而不管其电荷性质如何。这是因为电渗淌度一般比离子的电泳淌度大 得多，故当离子的电泳淌度方向与电渗流方向相反时，仍然可以使其沿电渗流方向迁移。这 样，就可在一次进样分析中同时分离阳离子和阴离子。中性分子由于不带电荷，故随电EOF 一起运动，故CZE模式不能分离不同的中性化合物。MEKC和CEC则可同时分离带电的和 中性化合物。CE 的分析参数可以用色谱中类似的参数来描述，比如与色谱保留时间相对应的有迁移 时间，定义为一种物质从进样口迁移到检测点所用的时间，迁移速率（v）则是迁移距离（1， 即被分析物质从进样口迁移到检测点所
14、经过的距离，又称毛细管的有效长度）与迁移时间（t）之比：因为电场强度等于施加电压（V）与毛细管长度（L）之比:根据电泳的基本公式：V =卩E,可得:lLtE tV卩被称为表观淌度，它是电泳淌度与电渗流淌度的矢量和，即:厂aaeEOF本实验采用一种中性化合物测定电渗流淌度，然后就可求得被分析物的有效淌度。注意，阴离子的有效淌度为负值，因为其与电渗淌度的方向相反。【仪器与试剂】样品I：浓度为2.00mgmL-i的苯甲醇的标准水溶液、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯甲酸的 标准水溶液，浓度均为1.00 mgmL-i。样品II：未知浓度混合样品。缓冲溶液：以缓冲盐的负离子浓度计，10 mmol.L-i的pH分
15、别为6.0, 7.0, 8.0的磷酸缓 冲溶液。配制方法为通过10 mmolL-i磷酸一氢钠和10 mmolL-i磷酸二氢钠的溶液互相混合 调整 pH 值,以保证缓冲溶液浓度一致。NaOH溶液（1.0 molL-1）,高纯水或超纯水。Capel-105RT电泳仪，60 cm长的熔融石英毛细管（有效长度51 cm）,内径50或75pm。5 mL 移液管 2 支， 1mL 移液管 2 支，分别标上四种标样的标签。10 mL 容量瓶 4个，滴管 2 支，分别标上标准、未知的标签。塑料样品管若干个，分别用于三种标准样品、未知样品、三种缓冲溶液、NaOH、水和 废液，做好标号。滴瓶一共5个，分别用于加装三种缓冲液、1 molL-1的NaOH和乙醇。 镊子、洗瓶、吸耳球、试管架、塑料样品管架、废液烧杯各一个。【实验内容】（1）仪器的预热和毛细管的冲洗 打开仪器（已经安装和毛细管）及计算机工作站，不加分离电压，设置毛细管温度为 25C。每次使用前对毛细管进行活化（先用NaOH冲洗20 min,纯水冲洗5 min，pH6.0缓 冲冲洗 5 min）。（2）不同缓冲溶液对分离的影响配制浓度分别为600，200，100，10.0聘mL-1的苯甲醇、水杨酸、苯甲酸、对氨基苯 甲酸的 10 mL 混合标样水溶液。待毛细管冲洗完毕，取1 mL（pH =6.0）混合标样，置于塑 料样品管进行分
