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1、药物浓度液质检测的方法学验证血药浓度方法学验证实验设计1. 标准曲线与线性方程 分别用血浆空白基质溶液配制环磷酰胺（ Cyclophosphamide） 阿帕替尼（Apatinib ）、多西他赛（Docetaxel ）、紫杉醇 （Paclitaxel）、伊马替尼（Imatinib ）这5种抗肿瘤药物的系列标准 溶液，浓度分别为 20、50、100、250、500、1000、2000、 4000ng/mL。质控品浓度分别为50、800、3200ng/mL。实验使用 液相色谱串联质谱仪进行检测，以这 5 种物质的浓度为横坐标，其对 应的响应值为纵坐标，获得这 5 种物质的标准曲线如图所示，线性范
2、围线性方程、相关系数（R）（表2.11 ）。5种抗肿瘤药物在 204000ng/mL 范围内获得了良好的线性关系其相关系数均可达到 0.99 以上，可以满足定量分析的条件。连续测定三天标曲，要求每个 浓度点三天的RSD 20%,才算满足标曲的稳定。2. 准确度和精密度、稀释稳定性&残留配置 20ng/ml （定量下限）、50ng/ml （低浓度）、800ng/ml （中浓度）、3200ng/ml （高浓度）4个血浆浓度的待测样本，按 “样品处理”操作，每个浓度取5 个平行，每个样品每天检测3 次， 进样量为5ul，评价批内精密度（CV ）及准确度（DEV）。连续检测4 天，用当日的工作曲线求得
3、浓度，评价批间精密度（CV ）及准确度 （DEV）。批内精密度（CV ）及准确度（DEV）v 15%，定量下限浓 度的批内精密度（CV ）及准确度（DEV）v 20%，认为准确度和精密 度良好。结果见下表。稀释稳定性评价：先配置一份远远超过标曲定量上限的基质样品 （如10ug/ml）,将这份样品用空白血浆稀释10倍（稀释后浓度落在 基质标曲中部10ug/ml-1ug/ml）,平行测定六分样品后评价其稀释 稳定性。连续测定三天。残留评价：比较高浓度样品对后续空白基质（不含混标、不含内 标的空白血浆）的影响：在基质标曲定量上限4000ng/ml后加空白。3. 提取回收率评价（1）预添加混标：配制5
4、0ng/m （低浓度）、800ng/m （中浓 度） 、 3200ng/ml （高浓度）的混合标准品基质血浆，按照“样品处 理”操作进行，每个浓度取5 个平行,每个样品重复检测1 次，进样量 为5ul，取均值；（2）后添加混标：将等量的混合标准品添加到用内 标乙腈处理过的基质血浆上清液中，每个浓度取5个平行，每个样品重复检测1次，进样量为5ul，取均值。将预添 加混标样本的检测响应值（样品的峰面积 *内标的固定值/内标的峰面 积）与后添加混标样本的检测响应值（样品的峰面积 *内标的固定值/ 内标的峰面积）进行比较，计算回收率。对于阿帕替尼没有内标来说， 是用检测峰面积进行比较，计算回收率。结果
5、见下表。4. 基质效应评价配制 50ng/m （低浓度）、800ng/m （中浓度）、3200ng/ml （高浓度）混合标准品基质血浆，取 10ul 混标加 90ul 待测血浆样本 和300ul混合内标品，震荡1min混匀后于12000rpm离心10min， 取 200ul 上清液。震荡混匀，待测，记录检测响应值（样品的峰面积* 内标的固定值/内标的峰面积） ；测得的响应值与纯乙腈中加入等量的 标准品和混合内标测得响应值的比值评价基质效应。每个浓度取 6 个 平行，每个样品检测1次，进样量为5ul，计算离子增强和离子抑制带 来的基质效应。对于阿帕替尼没有内标来说，是用检测峰面积进行比 较，计算
6、基质效应。5. 稳定性评价 纯溶剂储备液稳定性评价：相应的母液标准品浓度分别为 200ug/ml 5-氟尿嘧啶、 200 ug/ml 环磷酰胺、200 ug/ml 阿帕替尼 200 ug/ml多西他赛、400 ug/ml紫杉醇、200 ug/ml伊马替尼。用 相应的母液标准品，配置浓度分别为标曲上的50ng/ml （低浓度）和 3200ng/ml（高浓度）纯溶剂混标，每天测一次，直至出现拐点。 纯溶剂内标储备液稳定性评价：相应的母液内标品浓度为100 ug/ml （伊马替尼同位素内标浓度为50 ug/ml），用相应的母液内标品，配置接近加标样品中内标浓 度的一份大体积混合内标液，定溶液为乙腈，
7、配置20ml ,4弋冷藏保 存。每天测一次，直至出现拐点。样品稳定性评价：用终浓度为50ng/ml（低浓度）、 800ng/ml （中浓度）、3200 （高浓度）三个基质点评价。每天测一 次，直至出现拐点。6. 样品再评价将采集的临床样本如10份，将其处理后先在标曲和质控条件下进 行测定，每天都需要测定这10份，其中至少6份原始测定浓度和重新 测定浓度之间的差异应在两者均值的20%范围内。为了保证数据稳 健，可以一次多配制几份含内标和混标的含药血浆，上机前加乙腈除 蛋白。7. 定量限系列稀释标准品，每个浓度检测5次，将同时满足变异系数（CV ）v 25%、DEV 20%且信噪比大于10的最低浓度值定为定量下限。
