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1、实验一：琼脂糖凝胶电泳对 DNA 提取实验目的：学习使用水平式琼脂糖凝胶电泳进行DNA的提取。实验原理： 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有 一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电 荷效应和分子筛效应。根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分 开，用生物染料嵌入DNA分子后在紫外下显色。1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向 正极迁移。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的 双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极 方向移动。2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应， 即 DNA 分子本身的
2、大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构 型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。3）生物染料在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶 中从负极向正极泳动时，生物染料从正极向负极移动，就会嵌入 DNA 分子中形成络合物，使 DNA 在紫外光下发射很强的荧光。在生 物染料足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以 检测DNA的浓度。实验材料：微量移液器（2卩l和4 ul），高压灭菌锅，电泳仪，琼脂 糖平板电泳装置，微波炉等。TAE电泳缓冲液，琼脂糖凝胶，PCR 扩增样品实验步骤：1胶液的制备：称取0.2g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入20ml TAE 稀释缓冲液，
3、放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，沸腾。取 出摇匀。加热时应盖上封口膜， 以减少水份蒸发。2胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带（宽约1cm）紧密 封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子。3向冷却至50-60C的琼脂糖胶液中小心地倒入胶槽内，使胶液形成 均匀的胶层。检查有无气泡。4 室温下约 20 分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和 挡板，注意不要损伤梳底部的凝胶，清除碎胶。将凝胶放入电泳槽 中。5加入电泳缓冲液（TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1 mm。6加样：取2 u lPCR样品与2ul缓冲液液混匀，用微量移液枪小心 加入样品槽中。小心操作, 避免损坏凝
4、胶或将样品槽底部凝胶刺 穿。7 电泳：加完样后，插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电 压至160V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否 有气泡出现。8当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约lcm时，将电压（或电流）回 零，关闭电源，停止电泳。9取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。在波长为302nm紫外 灯下拍照观察。实验结果: 利用琼脂糖凝胶电泳实验做的图如下：结果分析：通过跑胶结果可以看出DNA的分离效果都很好，无 断裂，浓度可观，点样位置为第一排第16个，即第一排最后一 个。与Mark的对照有相吻合的条带，可进行下一步的判断与分 析。注意事项1 确保实验全程无污染2缓冲系统：在
5、没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或 迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能 导致 DNA 变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高 压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取 的。3 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶 解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的 凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。4 样品加入量：加样量的多少依据加样孔的大小及 DNA 中片段 的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖 尾和弥散，对于较大的 DNA 此现象更明显。5 电泳系统的变化会影响 DNA 的迁移，加入 DNA 标准参照物进 行判定是必要的。
