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1、mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下(除特别说明，均在4C下完成)：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液 A(0.25M 蔗糖,0.01M TrisHcl, 0.001M Na2-EDTA, pH8.0)中漂洗23次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。按组织重：缓冲液A=1 :510加入缓冲液A,用玻璃匀浆器冰浴匀浆。1.2 1000 gmin-1离心15min；取上清液；15000 gmin-1离心20min,弃上清，沉淀用缓冲液B (0.25M 蔗糖，0.05M TrisHcl, 0.007M Mg Cl2, p H7.5)洗涤，按 0.5m
2、Lg-1 肝的比例加入缓冲液B悬浮沉淀后加入DNase I至终浓度为100 ygm L-1, 30C下作用30min。1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液(0.25M蔗糖,0.1M Na2-EDTA, pH8.0)。15000gmin-1离心20min。沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。1.4 按 0.5 m Lg-1 肝加入缓冲液 C(0.1M Nacl, 0.05M TrisHcl, 0.01M Na2-EDTA, p H8.5)悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%1.5%,吸打混匀后37C保温15min。1.5 用等体积的苯酚,苯酚/氯仿(1:1),氯仿/
3、异戊醇(24:1)各抽提一次。取水相,加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4C冰箱中过夜。1.6 15000gmin-1离心30min后去上清;沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥,TE(0.01M TrisHcl,0.001M Na2-EDTA, pH8.0)溶解。1.7加入预处理的RNase I至终浓度为50ggm L-1, 37C保温1h。4C保存待用。越速离心法工作原理予意图细胞核/叶绿体、线粒体/溶酶体/过氧化物酶体、微体、核糖体等 由于细胞核与叶绿体的沉降速度相近，二者通过离心的方法较难分离.动物的新鲜材料、冰冻材料或甲醛浸泡材料（10mL STE匀浆缓冲
4、液/g）OXt匀浆700-2000 g 离心 10 15min上清液弃沉淀I 0七 15000g 20000g 离心 20 40min弃上清沉淀（壇复上述差速离心步骤 获得线粒体Janus gm B染色并 适当的NIE缓冲液悬浮 观察线粒体的数目、大小常温下;置罰加2倍变性液，混匀，冰浴5 lOnin加1.5倍复性液，混匀后静置30nin- IhrOX,12000g离心 5nin上消液1V弃沉淀加2.5倍无水乙醇或Of倍异丙醇-20弋沉淀30min弃上清 得粗制的mtDNA沉淀加入适量的| 1E完全溶解加 RNase（终浓度 200ufmL）, 37Y消化 30min 4hr等体积饱和酚（PH8.0）轻轻摇动15ninOX：, 12000g 离心 lOrrin上清液加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）,氯仿殖复上述操作用2.5倍无水乙醇或0.6倍异丙醇置于-20七沉淀30min lh0C12000g | 离心 lOrrin获得线粒体DNA1E溶解检测mtDNA纯度和浓度 置于- 20弋下备用（紫外分光光度计、限制性内切酶酶切或琼脂糖凝胶电泳）
