免疫学检测技术在食品安全中的应用汇编

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1、免疫学检测技术在食品安全中的应用杨明(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070 )食品安全问题在 21 世纪的今天已经成为全世界关注的重大问题，对国家的经济发展和消费 者的身体健康产生了重大影响。 随着我国市场经济的的不断完善和发展， 食品行业对外贸易与日 剧增，食品的质量与安全问题已成为影响农业和食品工业产品竞争力的关键因素。 同时，由于我 国人民生活已由温饱型食物结构转向营业健康型食物结构， 全民食品营业卫生知识得到普及。 人 民的饮食消费观念也由数量型转向质量型， 对食品卫生质量标准的要求越练越高， 这就对食品检 测技术提出更高的要求。由于食品种类丰富， 食品中检测的有毒有害物

2、质种类和组分繁多， 需要检测的物质质量极低， 样品中待检物的浓度常为卩g、ng甚至pg级，除此之外，许多检测物除需检测物质本身，还涉 及其衍生物和降解物测定。 区别同位异构体以及元素的价态等。 因此食品检测要求检测方法更加 准确、快速、方便，也使得其他学科的先进技术不断应用于食品检测领域中来，由于新技术的引 入，食品行业开发出了许多自动化程度和精确度很高的检测仪器， 这不仅缩短了分析时间， 减少 了人力误差， 也大大提高了食品分析检测的速度、 灵敏度和准确度。 现代食品检测技术主要包括 以下几个方面：计算机视觉技术；现代仪器分析技术；食品物性的力学、声学和电学检测 技术；电子传感检测技术；生物

3、传感技术；核酸探针检测技术；PCR基因扩增技术；免疫学检测技术。免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分， 特别是三大免疫技术荧光免疫 技术、酶免疫技术、 放射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用。 利用免疫学检测技术可检测细 菌、病毒、真菌、各种毒素、寄生虫等，还可用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、 抗生素等的检测，其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强，特别是单克隆抗体的发展，使 得免疫检测方法特异性更强，结果更准确。免疫分析是抗原与抗体的特异性、 可逆性结合为基础的分析技术。1959年，Yalow和Berson 将发射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了发射免疫测定法，

4、 从而开创了免疫分析这一崭新领 域，次后又发展了许多替代或非同位素免疫免疫分析法。1免疫荧光技术在食品检测中的应用免疫荧光分析(Immu no Fluoresce nee Assay , IFA)始创于20世纪40年代初，1942年Cons 等首次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体， 检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗体， 但此 种荧光素标记物的性能较差，未能推广应用，20世纪50年代，Riggs等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。 Mashall 等对荧光抗体的标记方法又进行了改进，从而使得免疫荧光技术逐渐推 广应用。1 1 基本原理抗体与荧光素结合后， 并不影响其与相应的抗原发生特异性反应

5、， 事先将待测抗原固定与玻 璃载玻片上， 滴加荧光标记抗体， 若荧光标记抗体与相应的抗原发生特异性结合反应， 不能被缓 冲液冲掉， 载荧光显微镜下可观察到荧光， 否则荧光抗体被缓冲液冲掉， 在显微镜下观察不到荧 光。1 2 荧光免疫测定法的分类根据标记荧光产生的方式不同分为底物标记荧光测定法、 荧光偏振免疫测定法、 荧光猝灭增 强免疫测定法。FIA可使用均相或非均相分析方式，均相 FIA应用较多。121 底物标记荧光测定法底物标记荧光测定法（SLFIA使用一种酶的底物标记待测物，底物本身无荧光，在受到相 应酶的催化时能转变为荧光物， 当标记底物与抗体结合产生的空间位阻阻碍了酶与标记底物间的 接

6、触，样品中的待测物通过竞争作用使游离的酶标结合物或荧光强度增加。122 荧光偏振免疫测定法使用偏振光作为激发光时， 视分子的运动状态， 发射的荧光可能是振动方向各向随机化的普 通荧光，或是只在某一平面振动的偏振荧光（ploarized fluoresce nee）在反应液中，游离的标记物分子体积小， 在布朗运动中转动速度快， 受偏振光照射后产生的荧光偏振方向被分散， 不能产 生偏振光，只发射普通荧光；与抗体结合的标记物分子体积增大，布朗运动速度减慢，甚至不能 转动而形成定向排列， 所以受偏振光激发后能产生偏振荧光， 样品中的待测物的量越大， 偏振荧 光的强度越高。123 荧光淬灭免疫测定法荧光

7、淬灭免疫测定法（ Fluoresecent Quenching Immunoassay 的原理是当荧光标记物与抗体 结合后发生荧光淬灭。 荧光猝灭的机制尚不清楚， 荧光淬灭可能与标记物与抗体结合后导致电子 振动状态的改变有关。124 荧光增强免疫测定法荧光增强免疫测定法 （Fluoresecent Enhancement Immunoassay 的原理与荧光淬灭增强免疫 测定法相似，不同的是标记物与抗体结合后荧光强度增强。2 酶免疫检测技术在食品检测中的应用酶免疫检测技术是在 20世纪 60年代在荧光和组织化学的基础上发展起来的一种新技术， 最 初用酶代表荧光素标记抗体作为生物组织中抗原的鉴定

8、和定位。 随后发展为用于鉴定免疫扩散及 免疫电泳板上的沉淀线，到1971年，Engrall等用碱性磷酸酶标记抗原或抗体，建立了酶联免疫 吸附试验（ELISA，这一技术因其高度的准确性、特异性、应用范围广、检测速度快以及费用低 等优点，是目前食品检测中令人瞩目的有发展前途的一种新技术。21 酶免疫技术的基本原理用酶标记已知的抗原（抗体） ，然后与样品在一定条件下反应，如果样品中含有相应的抗体 （抗原），抗原抗体结合形成复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原， 产生显色反应，这样就可以定性定量测定样品中的抗体（抗原）2 2 酶免疫技术的分类酶免疫技术发展迅猛， 种类繁多， 酶免疫

9、技术分为酶免疫组化技术和酶免疫测定技术， 酶免 疫测定技术又分为均相免疫测定和异相免疫测定技术， 异相免疫测定技术又分为固相免疫测定技 术和液相免疫测定技术。2 3 酶联免疫吸附测定技术231 基本原理抗体（抗原）与酶结合后，仍然能和相应的抗原（抗体）发生特异性结合，将待测样品事先 包被于固相载体表面，加入酶标抗体（抗原） ，酶将抗体（抗原）于吸附于固相载体上相应的抗 原（抗体）发生特异性结合反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液冲掉，当加入酶的底 物时，底物发生化学反应，呈颜色变化，颜色深浅与待测抗原或抗体的量有关，可定性或定量测 定抗原或抗体。ELISA常用的方法有直接法、间接法、双抗

10、体夹心法、双夹心法和竞争法。2 . 3. 2 ELISA技术在食品安全性检测中的应用及前景ELISA技术把抗原抗体特异性与酶反应的敏感性相结合，使食品在未经分离的提取的情况下，即可进行定性和定量分析。 近年来， 该技术在食品安全检测中正逐步推广应用， 用于细菌及其毒 素、真菌及其毒素、病毒、寄生虫的检测。还用于蛋白质、激素、农业残留、兽药残留和抗生素 及食品成分和劣质食品的检测分析。ELISA技术由于灵敏度高、特异性强、检测费用低和易于商 品化，具有十分广阔的应用前景。3 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术 （ Radio Immunoassay ,RIA） 是以放射性核素为标记物的标

11、记免疫分析法。 是 由Yalow和Berson于I960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性， 本法灵敏度高，测定准确性良好，特别适应于蛋白质、激素和多肽的精确定量测定。3 1 基本原理放射免疫分析的基本原理是标记抗原和非标记抗原对特异性抗体的竞争结合反应。 在这一反 应系统中，作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，抗体量一般采用能结合40-50%的标记抗原，而受检标本中的非标记抗原是变化的，根据标本中抗原的量不同，得到不同的反应结果。 当标记抗原、 非标记抗原和特异性抗体三者同时在于一个反应系统时， 由于标记抗原和非标记抗 原对特异性抗体具有相同的结合力， 因此两者相互

12、竞争特异性的抗体， 由于标记抗原与特异性抗 体的量是固定的， 故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。 非标记抗原量 增加， 相应的结合较多的抗体， 从而抑制了标记抗原对抗体的结合， 是标记抗原抗体复合物的量 相应减少， 游离的标记抗原相应的增加， 亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原 的浓度呈反比。 若将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分开， 分别测定其放射强度， 就可计算出 结合的标记抗原（B）与游离的标记抗原（F）的比值（B/F）,这与标本中的抗原呈函数关系。用 一系列不同的标准抗原进行测定，计算相应的 B/F 值，可得到一条剂量反应曲线，受检标本在同 样条件下

13、进行测定，计算 B/F 值，即可在剂量反应曲线是查出标本中的抗原含量。放射免疫测定分为液相放射免疫测定和固相放射免疫测定。3 2 放射免疫技术在食品检测中的应用RIA测定就是应用放射性物质代替 ELISA中的标记酶作为抗原或抗体耦联物，在食品安全检 测中最常见的同位素是3H和14C。1978年，Charm在RIA技术的基础上发展了放射免疫检测技术 （RRA,放射免疫检测在快速检测方面最成功的是Charmn 6600/7600抗生素快速检测系统，该系统就是利用专一受体来识别结合于同一类抗生素族中的母环以便最快速同时检测同一抗生素 族在样品中的残留情况。目前，Charmn 7600检测系统就B内酰

14、胺类、氯霉素类、四环素类、 磺胺类、氨唑西林及碱性磷酸酶这六项检测以被FDA认可。放射免疫技术由于可以避免假阳性，适宜于阳性率较低的大量样品检测， 对水产品、 肉类产品、 果疏产品中的农药残留量的检测中广 泛应用。 还可检测经食品传播的细菌及毒素、 真菌及毒素、 病毒和寄生虫及小分子物质和大分子 物质。如南京农业大学用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白。4免疫胶体金检测技术在食品检测中的应用免疫胶体金检测技术又叫 Rosa.Tests 法，是利用胶体金颗粒进行标记的一项新技术。41 基本原理氯金酸（HAuCl）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成负电的疏水胶溶液， 由于静电作用而成为稳定

15、的胶体状态， 故称胶体金。 胶体金标记， 实质上是蛋白质等分子被吸附 到胶体金颗粒表面的过程， 吸附机理可能是胶体金颗粒表面带有负电荷， 与蛋白质的正电荷基团 因静电吸附而行形成牢固结合，用已知还原法可以方便地从HAuCl4 制备各种不同的粒径，不同颜色的胶体金颗粒，这种球形的颗粒对蛋白质有很强的吸附功能， 可以与葡萄球菌A蛋白、毒素、 免疫球蛋白、糖蛋白、酶、抗生素、激素等非共价结合。免疫胶体金检测原理是利用了金颗粒具有电子密度的特性， 当这些标记物在相应配体处大量 聚集时， 肉眼可见红色或粉红色斑点。 因而可用于定性或定量的快速检测方法中。 这一方法可通 过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金

16、银染色。42 免疫胶体金技术在食品检测中的应用该技术当前主要用于在牛奶中检测抗生素， 可在十分钟内快速检测牛奶中的抗生素， 利用该 技术可检测的抗生素种类有六种，B内酰胺、四环素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星和黄曲霉毒素， 可检测的B-内酰胺药物有氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素头抱噻呋、头抱霉素和青霉素G等。由于该技术结果直观、操作简单，在食品安全检测中有广阔的应用前景。5 单克隆抗体技术在食品检测中的应用抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因， 如果能选出一个 制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可以得到由单细胞经分裂增殖而形成的细胞群，即克隆。 单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体。 1975年， Kohler 和 Milstein 发现将小鼠骨髓瘤细胞和 绵