氧化石墨烯荧光淬灭

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1、1我报告的题目是基于碌酸化多肽降解受阻的石墨稀/多肽复合焚光探针用于蛋白激酶活性及抑制作 用分析2蛋白激酶催化作用下的蛋白质憐酸化是生物体内翻译后修饰的重要方式之一。蛋白质的憐酸化和去 磷酸化这一可逆过程几调节着细胞的发育、增殖、分化、信号转导、神经活动、肌肉收缩、细胞凋亡 及肿瘤发生等过程在内的大部分生命活动。非正常的磷酸化会导致人体产生各种疾病，例如癌症或老 年痴呆症等。因此，准确灵敏地检测过度磷酸化、分析蛋白激酶活性和高通量蹄选高效抑制剂对于人 类一些重大疾病的早期诊断和治疗极为重要。传统用于蛋白激酶活性分析的方法依赖于放射性元素标记伽马-32P-ATP法，由于放射性物质对环境 及其人体

2、的危害而随之被取代，基于憐酸特异性识别抗体的免疫技术146、突光分析方法表面等离子 共振技术184,185以及质谱等都能有效用于蛋白激酶的活性分析。石墨稀(Graphene),是从石墨材料中剥离出来的由碳原子组成的二维晶体，是目前己知世界上强度最高的材料。石墨稀具有独特的电子、机械、热力学特性在化学、质量、压力等传感应用中独具优势,。与碳纳米管相似,石墨烯对有机荧光分子表现了有效的突光淬灭效果,这一过程中同时发生了激发态突光分子与石墨烯表面之间的能量转移和电子转移。2010年诺贝尔物理学奖氧化石墨烯薄片是石墨粉末经化学氧化及剥离后的产物，氧化石墨烯是单一的原子层，仍然具有淬灭 荧光的效果3本文

3、首次提出了一种基于多肽/石墨烯突光浮灭机制和接肽酶降解作用的激酶活性分析方法。酪蛋白激酶CKII是一种重要的丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶，能磷酸化160种不同的蛋白质,我们以CKII为蛋白激酶模型。FITC标记的CKII底物多肽,FITC-peptide(FITC-RRRADDSDDDDD),能与GO发生有效的突光浮灭。幾肽酶CPY是一类肽链端解酶，作用于任何一个C-末端残基，从肽链的C端开始逐个降解,释放出游离氨基酸。FITC-peptide在CPY的消化作用下释放出游离的FITC分子，在高离子强度环境下，游离FITC分子与GO之间的吸附较小而保持相当强的焚光。而当FITC-peptide在

4、CKII/ATP催化发生磷酸化，有效地阻碍CPY在憐酸化丝氨酸位点的降解，使得FITC-多肽更容易与GO结合导致焚光淬灭。1羧肽酶CPY作用于任何一个C-末端残基 逐个降解释放游离氨基酸，并释放出游离的 FITC分子，在高离子强度环境下(猜想，故而加了氯化镁和钾)，与GO之间吸附较小保持相 当强的荧光4.梭肽酶(carboxypeptidase Y,CPY)、Staurosporine、弗斯可林(Fskorlin)和 3-异丁基-1-甲基黄嘿吟(IBMX)购买于西格玛公司(中国上海)。cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA，催化亚基)购买于Promega公司，酷蛋白激酶II (CKII)购买于New

5、 England Biolabs公司(美国)。突光素标记底物多肽:FITC-RRRADDSDDDDD ( FITC-pep )、FITC-RRRADDpSDDDDD (FITC-Ppep)和 FITC-LRRASLG (FITC-kemptide) ATP、蛋白酶抑制剂和改良型 Bradford 蛋白总浓度检测试剂盒牛血清蛋白(BSA)、三轻甲基氨基甲焼(Tris)、甘油、DTT、EDTASynergy Mx酶标仪(BioTek仪器有限公司)进行突光光谱分析,所有样品用480 nm作为激发波长，从500 nm到700 nm (25 C)扫描焚光发射谱图。5氧化石墨稀与多肽 FITC-pep之间

6、的劳光淬灭(氧化石墨烯对荧光强度的影响)FlTC-peptide+ TBS+ Tris-HCl+ MgCb+ KCl+氧化石墨稀在96孔酶标板中加入60 nL浓度为的多肽(FITC-peptide)溶液(溶于 TBS,即 20 mM Tris-HCl,10 mM MgCb, 50 mM KCl, pH 7.5)每孔中加入5 pL氧化石墨稀(浓度40 lig ml/i),设定酶标仪混勻1 min,在480 nm激发下扫描500 nm至700 nm的突光发射光谱。考察氧化石墨烯的浓度因素时,加入石 墨稀的浓度依次为 0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mU), 酶标仪

7、设定程序同上。考察FITC-peptide的多肽片段对氧化石墨稀的亲和力时， 用游离的突光素FITC分子作为参照，与石墨稀在酶标板中混勻1 min后进行劳光 检测,程序同上。6氧化石墨稀(GO)与多肽之间通过亲疏水性、电子共辄、电荷吸附等发生相互作用。氧化石墨稀(GO )含有亲水性的离子化边缘和疏水性的中间片层因而 具有两亲性,当突光染料标记的多肽与石墨烯共存时,由于亲疏水作用、电荷吸 附等作用而导致多肽结合在GO表面，荧光染料分子与GO发生较强的能量转移 而导致焚光萍灭。当增加GO的浓度,FITC-peptide在520 nm处的焚光强度随之剧烈降低,GO 浓度为50 lag ml/i时,F

8、ITC-peptide劳光强度与萍灭之前相比，下降至15%,萍灭程度非常高。而游离的FITC分子在与GO混 合之后，随着GO浓度的增加,FITC突光分子的焚光强度没有很明显的下I降,当GO浓度为50 iAg mL时,FITC分子的突光仍保持了 90%,这说明GO对FITC-peptide突光浮灭作用要远远大于游离的FITC分子，同时多肽片段因为能很 好的与GO结合,导致了 FITC更易于GO接近，发生电子传递的劳光浮灭7羧肽酶消化多肽底物(CPY浓度对荧光强度影响)100AlL浓度为10liM的多肽(FITC-peptide)溶液中，加入3.29 U mL/i的接 肽酶CPY恒温25。(:孵育

9、30 min,取反应液60人1与氧化石墨稀(浓度40 Aig ml/i) 在酶标板中混勻1 min后进行劳光检测，程序同上。考察梭肽酶CPY对憐酸化多 肽(FITC-Ppep)的消化作用时，釆用同样浓度的FITC-Ppep多肽(10 AM)与CPY作用,然后与石墨稀混合测突光发射光谱。考察接肽酶CPY对此浓度的多 肽的消化所需量时，在多肽溶液中加入CPY的浓度为:0-13.16UmL人其余条 件一致。FITC-peptide/FITC-Ppep+CPY+氧化石墨稀+其余条件8检测PKA活性和抑制作用(研究不同激酶活性，激酶浓度的影响。CKII中加抑制剂浓度 的影响)蛋白激酶CKII催化的憐酸化

10、反应条件为:含有10AiM多肽(FITC-pep)、0.1 mMATP、10 U CKII、20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCb, 50 mM KCl 的反应混合 液(pH7.5)在恒温30 C反应1小时。蛋白激酶PKA催化的磷酸化反应条件为： 10A1 肘多肽(FITC-kemptide)、0.1 mMATP、10 U PKA、50 mM Tris-HCl, 10 mMMgCh的反应混合液(pH7.5)在恒温30 C反应1小时。激酶催化憐酸化反应完 成后，取100反应混合溶液，加入3.29 U的接肽酶CPY恒温25 C孵育30 min,再取60 liL CPY消化后的反应液与

11、氧化石墨烯(浓度40 l_ig ml/i)在酶标板中混匀1 min后进行突光检测，程序同上。分析蛋白激酶CKII的活性实验中,120 a；!a憐酸化反应液中加入不同浓度的激酶，即0-100 U。考察Staurosporine或H-89对激酶CKII的抑制效果时，在激 酶催化磷酸化反应时，加入lOUCKII,同时加入不同浓度的Staurosporine (0 - 20IAM)或 H-89 (0 - 0.2 mM).9 了两种广谱小分子抑制剂:Staurosporine、H-89来进行考察。在CKII催化憐酸化反应缓冲液中，加入一系列浓度的激酶抑 制剂Staurosporine或H-89,反应完成

12、后，加入CPY消化,然后与GO结合之后 检测突光强度，实验结果见图5.12。如图5.12A所示，随着Staurosporine浓度的 增加(0 - 20 AM),多肽/GO复合物的突光依次增加,这表明Staurosporine对激 酶CKII活性有很好的抑制作用，当Staurosporine的浓度达5 laM时，抑制作用达到最强。从焚光强度对 Staurosporine 浓度的对数关系图得到 Staurosporine 的抑制曲线，可以估算出Staurosporine对CKII的ICso值(最大抑制的50%对应的浓度) 为94nM,这与以往文献报道值接近2 4。另一方面,H-89对CKII活性

13、的抑制作 用在图5.12B中体现，在激酶催化憐酸化反应中，改变抑制剂H-89的浓度(0 - 200HM),随着H-89浓度旳增加，多肽/GO复合物的焚光强度也依次增加，这表明生物纳米材料构 建蛋白激酶活性传感与蛋白质直接电化学H-89对激酶CKII催化反应的抑制,相应的憐酸化水平逐步降低。通过焚光强度对H-89浓度对数关系作图，得到H-89的抑制曲线。可以估算出H-89对CKII的IC50值是1.18 laM,这与以往文献中报道值相当比较Staurosporine和H-89对CKII活性的抑制作用结果，我们发现两种小分子抑制剂对CKII的抑制能力是不一样的Staurosporine的ICso值

14、要明显小于H-89的,这说明Staurosporine的 抑制能力更强。因此，上述结果证实了我们提出的这种基于CPY消化作用及GO 突光萍灭作用的激酶活性分析方法，不仅能有效检测小分子抑制剂，而且能用于 蹄选激酶抑制剂。10MCF-7 细胞培养和裂解液的准备MCF-7细胞(一种乳腺癌细胞)(1 X 105个细胞)培养在含有10%的胎牛血清,转录非必需氨 基酸溶液(0.1 mM), 1%胰岛素-转铁因子-硒补充剂,青霉素(lOOUml/i),链霉素(100mgmL_i),两性霉素B (0.25 mgrnL)的培养液中。细胞在包含5%C02的湿度氛围中孵育(37 C)。用无血清培养基(ImL)代替

15、细胞培养基在刺激之前培养4小时，培养基中加入用二甲基亚砜(DMSO)配制的不同浓度的Fosklin/IBMX (抑制细胞增殖)混合液(lOpL,Fosklin/IBMX最终浓度在图6A插图中显示) 来激活细胞内的PKA。DMSO (10 laL)代替Fosklin/IBMX添加到培养基作为未激活 样品。激活30分钟后，将细胞转移至憐酸盐缓冲液(D-PBS)中，通过超声(200W)2秒X60次，每次间隔3秒钟的方法超声破碎细胞。再将细胞裂解液在转速22 000 rpmA 4。C下离心60分钟，取上清液备用。使用改良型 Bradford 总蛋白浓度试剂盒来估算细胞裂解液的总蛋白浓度,其 用牛血清蛋

16、白(BSA)作为标准。不同浓度的BSA标准溶液(5-30lagniI/i)和Bradford反应物孵育10分钟，用紫外-可见光谱得到该溶液在595 nm的吸光度， 标准浓度对吸光度的校正曲线通过线性关系得到。最后，将细胞提取物与Bradford 反应试剂混合，用上述提到的方法检测。总蛋白浓度通过参照标准曲线计算。所 有细胞裂解液的总蛋白浓度稀释为8 ml/i用于激酶活性实验11。FITC-多肽的突光萍灭程度用(Po-PyPo来计算,/0为FITC-多肽与GO结合之前的焚光强度,P为FITC-多肽与GO结合后的突光强度。如图5.14所示,FITC-kemptide在1号裂解样品参与的憐酸化下，经CPY消化和GO的结合后，表现的突光萍灭程度最低(Po-P