双酶切连接全攻略

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1、双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重 组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个 人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制 酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII, 提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶 切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： http:/ 3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。纯化问题：纯化

2、PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大 块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基 肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是 TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 pl反应液中，30C温 度下反应1小时，将1 pg的入DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位（U）。而该酶浓度 约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15pg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3pg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3pg，所

3、以即便全部加 进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的 载体片段：回收的PCR产物片段=1： 10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为pg单位的DNA： （X pmolesx长度bpx650）/ 1,000,000（注：长度bpx650是该双链DNA的分子量）所得数值即为|jg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66pg,如载体是 5380bp，则 0.03pmol 为 0.03x5.38x0.66=0

4、.106524|jg。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用 MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 pl 的连接反应体系中，6四的入DNA-Hind III的分解物在16C下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/pl , 所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。3、转化:a、全量（10叩加入至100 pl JM1

5、09感受态细胞中，冰中放置30分钟。b、42C加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。、加入890 pl AMP阴性培养基，37C振荡培养60分钟。取100pl铺板。也可离心后余100pl几个非常重要的问题1做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险 起见，一般连接3小时,16度.2对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无 法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的 时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下

6、对照：A酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER,跑胶，看单切的两管是否成线性.如两 管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照设4个：A. 即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克 隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培基, 连接酶都正常的情况下.B. 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何 酶切的原始质粒C. 设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.D. AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况.4. 所有

7、的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够 了。然后双酶切鉴定，测序。昨天14个测序结果出来，全部是阳性克隆。两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。 回顾自己的实验现补充几点。就上面的对照简要说一下我的结果。转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆， 约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行 PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接 用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，

8、长得克隆较大，很好挑选。下面简要的说一下对照的结果。A只长出了 3个克隆，以100的基数计算，约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了 单酶切B约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%C长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。D长了很多克隆，证明感受态没有问题。这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。JM108感受态细胞的制备刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了 10支。后来干脆自己做，感觉 质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。前期工作分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓磨刀不误砍材功

9、。 注意事项1. 不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从一70r或-20C甘油保存的菌种划板（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划S行。同时记得设 立对照：A、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，实验室很多材料从 师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP 阴性空白培基。系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑 克隆。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率 与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过

10、多或体积过大时，转化 效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50pl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5%。不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体 系25微升）会全量加到200微升的感受态里，约为150ng （载体0.1微克，目的片段约0.05 微克）。效果也好。3. 试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制,最 好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的，好像是陇西化学制剂， 分析纯。4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管, tip

11、头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不 必要的麻烦。培养基的配制1. 配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基:精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠l0g， 加去离子水800ml充分搅拌溶解，用1mol/LNaOH调pH7.0,补加去离子水至1000毫升， 高压灭菌，4度保存。我一般没有用1mol/LNaOH调pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g，酵 母抽提物5g，氯化钠l0g加去离子水至1000ml。2. LB固体培养基：LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭

12、菌消毒；3. Amp母液：用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100 ug/ul溶液，置-20C保存； AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5支分装（浓度100mg/ml即100 ug/ul）。4. 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60C左右，加入 Amp储存液，使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：即多少毫升培养基加多少 微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半量则最终浓度为50ug/ml有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通培基，效果 也很好。5.0.05mol/L

13、CaCl2溶液:我们实验室只有CaCl2-6H2O，分子量219，配制100ml的，则 需称量0.005x219=1.095g就可以了。其实氯化钙的摩尔浓度在0.05-0.1mol/L均可。溶于 50ml重蒸水中,定容至100ml，高压灭菌。6.含15%甘油的005mol/L CaCl2:先配制成0.1mol/L的氯化钙溶液50ml，加入15ml 甘油,定容至100ml，高压灭菌。有文献说要用0.22的滤器，其实完全没有必要。高压即可。准备工作做好了，就可以开工了。一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落，接种于3-10ml LB液体培养 基中,37C下振荡培养12小时左右（一

14、般过夜）。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于 10ml试管（如较多制备，多用几个试管即可）的LB液体（AMP阴性）培养基中同时做空 的培基对照,37C振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。二、感受态细胞的制备（CaCl2法）1、将培养液分转入1.5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1.5ml的离心管中）， 冰上放置10分钟,然后于4C下3000g离心10分钟。2、弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液200微升轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟 后,4C下3000g离心10分钟。3、弃去上清，加入200微升预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2

15、溶液,轻轻悬浮细胞，冰 上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。4、贮存于-70C可保存半年。要点：1.悬浮细胞时动作一定要轻柔；2冰上。掌握者两点可谓掌握了制备感受态的精髓， 无往不利。我五月初做实验时遇到很多问题，那时是相当的郁闷。当时参考了丁香园很多战友有益的 相关帖子，获益颇丰，谢谢丁香园提供了这个交流平台。希望大家不断补充，纠正错误， 知无不言，言无不尽。尽量让后来者少走弯路节约时间，尽量少过郁闷压抑没有成就感的 日子。蓝白斑筛选蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如a-互补、抗 生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有伊半乳糖 苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多 克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到6-半乳糖苷酶的氨基端 而不影响功能，这种载体适用于可编码伊半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿 主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。 这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实 现了互补，称为a-互补。由a-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，