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1、真核生物基因绢的特点：基因组含有更大的DNA分子，以染色体形式储存于细胞核内基因组结构复杂，有多个 复制启始位点，但每个复制子的长度较小。转录单位一般是单顺反子的存在重复序列存在多基因家族和超基因 家族基因类型多样含有自私DNADNA序列组织的可变性原核生物基因组特点：细菌的DNA绝大部分是用于编码蛋白质的，只有一小部分是不翻译的细菌的结构基因中 没有内含子成分，即基因序列是连续的细菌的结构基因无重叠现象，即同一部分DNA序列不编码两种蛋白质多肽 链。功能上相关的几个结构基因串联在一起组成操纵子结构。当基因开放时，这几个基因转录在一条mRNA链上， 然后翻译成几条功能相关的蛋白质多肽链，故称之
2、为多顺反子。高度重复顺序的功能：调节反向序列常存在于DNA复制起点区的附近。参与基因表达的调控DNA的重复顺序 可以转录到核内不均一 RNA分子中，并形成发夹结构，这对稳定RNA分子，免遭分解有重要作用。参与转座作用： 几乎所有转座因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到到 1400bp。与进化有关：不同种属的高度重复顺序 的核苷酸序列不同，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不 一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹.a卫星DNA成簇的分布在染色体着丝粒附近，可能与减数分裂 时染色体配对有关，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专
3、一性的特定卫星DNA顺序.自私DNADNA 序列组织的可变性外元与内元顺序组成的一些特点：基因组中的各个外显子的排列顺序与成熟mRNA中对应的外显子顺序保持一致 断裂基因在个体的所有组织细胞中，不论表达与否，其结构不变绝大多数内元都含有3种可能读码框的终止密码 子，当内元未被切除时，翻译常常在内元终止，产生残缺的多肽链不同种属的同一基因中，外元的顺序组成比较保 守，而内元的顺序变异较大外元的长度一般小于300bp，内元的长度较大，可达50-60 kb甚至更长。基因组测序的箫略： 全基因组鸟枪法：首先进行全基因组鸟枪法测序，再以基因组图的分子标记为起点，将鸟枪法DNA片段进行组装。 根据高密度的
4、基因组图分子标记，检测组装片段是否处在正确的位置，校正因重复顺序的干扰产生的序列误排。这是 一种由下至上的测序策略。 克隆重叠群法：克隆重叠群：相互间存在重叠顺序的一组克隆。根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接，覆 盖的物理长度可达百万级碱基对。在单个的重叠群中，采用鸟枪法测序，然后在重叠群内进行组装。这是一种由上至 下的测序策略。形态标记的不足：可以观察到的标记非常有限，难以建立饱和的遗传图谱许多形态标记还受环境、生育期等因素 的影响性状的识别需要有相关的经验DNA羊标记特点：不受季节、环境、基因表达与否的限制多态性高，存在着丰富的等位变异数量丰富，多 态性遍及整个基因组表现为“中性”，
5、不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁许多分子标记表现共显 性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。三代分子标记及特点：RFLP： RFLP最初的设想及局限，第一代标记，包括AFLP和RAPI SSLP：第二代分子标记1）小卫星特点：重复单位长10bp，重复数1030，分布集中，产生于不等交换，但不适合自动化PCR。2）小卫星特点：重复单位长16bp，重复数1050，分数分布，产生于测序复制 SNP第三代分子标记特点：人类基因的平均分布为每kb 一个SNP，总数约300百万。RFLP标记的特点：遍布于整个基因组，数量几乎是无限的无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制共显 性，可区分纯
6、合子和杂合子结果稳定、可靠DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。RFLP的操作步骤：DNA提取用DNA限制性内切酶消化凝胶电泳分离限制性片段将这些片段按原来的顺序 和位置转移到易操作的滤膜上用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交放射性自 显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。SSR （简单重复序列）的主要功能：编码氨基酸染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢 失的功能提高或降低临近基因转录速率基因重组的热点，是基因变异的来源SSR （简单重复序列）的特点：两侧顺序保守，在同种间多相同数量丰富，在整个基因组均
7、匀随机分布实验重 复性好，结果可靠多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异共显性标记，可鉴别杂合子和纯合 子仅需微量组织，适合PCR分析半自动化SSR （简单重复序列）不足：相对的物种专一性由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝 序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长实际分析时一般每 次只分析单个位点不同引物退火温度不同，需要探索。SNP用作遗传标记的特点：双等位基因在基因组中的发生频率比较高SNPs可大大丰富既有的连锁图成熟自 动化技术，有望同时分析成千上万的SNPs构建水稻遗传图谱的方法：选择亲本建立构图群体选择多
8、态性探针检验多态性探针在群体中的表现连锁分 析和连锁群构建确定连锁群与染色体的关系水稻基因组的测序与组装：构建物理图在重叠群中挑选出一套彼此重叠最少的有序克隆对每个BAC克隆进行 亚克隆用DNA测序仪随机测定亚克隆顺序建立起亚克隆序列重叠群用“半随机法”延伸亚克隆序列重叠群的长 度定向测序完成序列构建遗传图谱的原因：基因组图的绘制是基因组全面测序的工作框架绘制物理图的原因意义（绘制的基因组图为何不能指导基因组计划的测序）：遗传图的分辨率有限遗传图的精确此内容仅供参考性较低根据遗传研究所得的有关信息，人们可指望利用物理图获得预期有用的基因物理图为测定全基因组DNA 全序列提供了必要的“骨架”。物
9、理作图技术：限制性作图：它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。依靠克隆的基因组作图：根 据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群，绘制物理连锁图。荧光标记原位杂交：将荧光标记的探针与染色 体杂交确定分子标记的所在位置。顺序标签位点作图：通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA 区段中。为什么构建最为详细的大基因组物理图的主流技术为STS绘图：限制性作图虽然快速，并可提供详细的信息，但 不适合大基因组。重叠群构建程序复杂，费时费力。指纹作图对大基因组仍存在不少问题，如选用的限制酶不当或 重复顺序干扰，会出现误排。至于原位杂交因其操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子
10、标记不超过3-4个。 构建最为详细的大基因组物理图的主流技术为STS绘图。限制性作图的基本原理：最简单的构建限制图的方法是比较不同限制酶产生的DNA片段的大小。首先用一种限制酶 处理样品，经琼脂糖凝胶电泳分离染色后可见大小确定的DNA片段。然后用第二种限制酶处理获得第二组片段。最 后用2种酶混合处理，获得第三组片段。收集所有上述资料进行对比组装，对于2种酶切位点交替出现的区段，利用加减法既可确定酶切位点的相对位置。DNA测序（基因组）的方法：1）链终止法原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳能分辨出长度只差一个核苷酸的单链DNA分子。链终止法测序中，通过合成与单链DNA 互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子
11、的顺序，合成的互补DNA单链可在任意一个碱基位置终止，从而产生所有 仅差一个碱基的单链分子。链终止法对DNA聚合酶的要求：高酶活性无5-3,外切核酸酶活性无3-5，外切核酸酶活性过程：制备单链模板将单链模板与一小段引物退火加入DNA聚合酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双 脱氧核苷酸将4种反应产物分别在4条泳道电泳根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列2）化学降解法原理：在选定的核苷酸碱基中引入化学基团再经化合物处理使DNA分子在被修饰的核苷酸位置降解。4种核苷酸A， C，G和T均可分别修饰，分别降解，形成只差一个核苷酸的降解DNA群体。起始DNA样品为双链DNA，在测序 前要将其转变为单
12、链。每个单链的同一方向未端都结合了放射性同位素标记，可显示DNA条带的位置。可采用不同 的方法获得不同的末端处理单链，由此读取所有碱基顺序。过程：将双链DNA样品变为单链每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记，以便显示DNA条带分别用 不同方法处理，获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳，读取DNA的核苷酸顺序3）自动化测序（荧光标记测序）原理：不同荧光色彩的标记化合物可分别与指定的dNTP结合，四种标记的ddNTP混合加入一个反应中可得末端分 别带有ACTG的DNA单链，每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，可由计算机读出碱基并测序。过程：以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有一种代表
13、颜色整个反应在一个试管中进行当新合成的终止单 链通过荧光监测仪时，可由光信号读出未端核苷酸，并由电脑记录。优点：免除了同位素标记必需同时进行四组反应的麻烦，简化为由一个泳道同时判读四种碱基自动化荧光测序系 统极大地提高了测序的效率，为基因组大规模测序提供了可能。避免肉眼分辨减少了差错，阅读信号与计算机相连 后可直接对数据进行电脑处理，加快了基因组测序的进程。4）非常规测序（光点测序/焦磷酸测序）：原理：当每一个配对的核苷酸加入到正在生长的新链未端时，根据发出的信号直接判读。脱氧三磷酸核苷酸连接到 DNA 3，-末端时会释放一个PPi，PPi在磷酸化酶的作用下转换为化学能，并发出光亮。过程：每次
14、只加入一种dNTP，如果该核苷酸不能与模板链碱基配，很快会分解。如果加入的dNTP可与模板链碱基 配对便会渗入生长的新链同时释放PPi，这一过程会伴随化学发光，可由仪器监测记录。根据每次加入dNTP及其发 光反应，可以读出完成的测序序列。优点：无需ddNTP，只需dNTP。制备单链DNA的方法：质粒载体克隆单链DNA以M13载体克隆单链DNA,在噬菌体M13基础上改造后专门用 于制备单链DNA样品的方法以噬菌粒克隆DNAPCR产生单链DNAShotgun测序（随机测序与序列组装）的过程：DNA的提取和纯化载体预备：和DNA片断结合，从而能够在细 菌中扩增DNA片段的制备：将DNA用超声波切成能
15、够测序的小片断转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中 进行扩增提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒电泳检测：检测质量的好坏测序：上测序仪测序EST测序的优点：mRNA可直接反转录为cDNA，并很易构建cDNA文库只需一次cDNA测序即可获取EST的 顺序，500 bp的cDNA序列足以鉴定所代表的基因不必反复检测EST顺序的准确性。人类基因组测序策略：构建BAC克隆限制性酶处理获得指纹根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群根据 STS标记，将BAC克隆重叠群标定在物理图上每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序，组装将BAC插入顺序与BAC 克隆指纹及重叠群对比，将已阅读的顺序锚定到物理图上随机测序与序列组装（鸟枪法）战略的优点和局限是什么？优点：可以组建一条流水工作线，一个科研小组可进行任务分工，一部分人专门负责制备DNA，一部分人负责测 序或数据分析速度快无需提供相关的遗传图与物理图局限：结构过于复杂，序列组装的起始阶段工作量非常大数据分析还有赖于基因组中是否存在十分棘手的小重复 顺序及其数量对一些缺少重复顺序的小基因组而言，鸟枪法仍不失为最佳的选择，但对情况复杂的大基因组的测序 还要考虑更加有效的策略。人类基因组测序的伦理学问题：专利问题人类基因组顺
