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1、婴儿型多囊肾家系PKHD1基因的突变分析郭小艳;王志红;廖娟;周春燕;王鸿;耿丹明;兰风华【摘要】目的对1个婴儿型多囊肾家系的致病基因PKHDI进行突变分析.方法 先证者母亲怀孕两次,胎儿均在围产期死亡,且两次胎儿彩超结果相似,符合多囊肾改 变提取先证者父母及其他成员外周血基因组DNA,PCR扩增PKHD1基因编码区 并进行序列测定；找到突变后,对相应PCR产物进行酶切鉴定或变性高效液相色谱 分析,以证实突变.结果先证者家系成员序列分析表明，其父和祖母PKHD1基因第 59外显子存在杂合突变（C.9901G T）,其母和外祖母PKHD1基因第53外显子存 在杂合的缺失突变（c.8317delG
2、）两个突变均导致mRNA提前出现终止密码子.结 论发现两个新的PKHD1基因突变；若胎儿同时遗传了这两个突变,将导致婴儿型 多囊肾的发生.期刊名称】 分子诊断与治疗杂志年(卷),期】 2012(004)004【总页数】6页（P227-232）【关键词】婴儿型多囊肾；PKHD1基因;基因突变;突变分析【作 者】 郭小艳;王志红;廖娟;周春燕;王鸿;耿丹明;兰风华【作者单位】 福建医科大学福总临床医学院（南京军区福州总医院）临床遗传与实验 医学科,福建,福州350025;福建医科大学福总临床医学院（南京军区福州总医院）临 床遗传与实验医学科,福建,福州350025;福建医科大学福总临床医学院（南京
3、军区福 州总医院）临床遗传与实验医学科,福建,福州350025;福建医科大学福总临床医学院 （南京军区福州总医院）临床遗传与实验医学科,福建,福州350025;南京军区福州总 医院超声诊断科,福建,福州350025;南京军区福州总医院超声诊断科,福建,福州 350025;福建医科大学福总临床医学院（南京军区福州总医院）临床遗传与实验医学 科,福建,福州350025【正文语种】中 文常染色体隐性多囊性肾病（autosomal recessive polycystic kidney disease , ARPKD ）是一种严重的遗传性肾肝疾病，典型者在婴儿期发病，因此，ARPKD通 常又被称为婴儿
4、型多囊肾病。其发病率为1:20000,人群携带者为1:701。 30%50%的患病胎儿因羊水过少导致肺发育不全而在围产期死亡，此期主要为 肾损害。影像学检查主要表现为双肾收集管的非梗阻性梭形膨大，回声增强，呈陶 土样“Potter”羊水过少症。如果渡过新生儿期，则大约一半的患儿会进展至终末 期肾病2,3。部分患者在儿童期或成年后才发病，主要表现为肝损害（肝小叶间 导管的增生和扩张）和肝门纤维化（卡利综合症）等4。ARPKD的致病基因为多 囊肾和肝脏疾病 1 （ polycystic kidney and hepatic disease 1 , PKHD1 ）。目前 报道的基因突变数达702个（
5、http:/ www.humgen.rwth-aachen.de ）。我科接 诊了一个ARPKD家系，经基因序列分析发现了 2个PKHD1基因新突变，这不仅 充实了突变数据库，也为该家系开展产前分子诊断奠定基础。1.1 病例资料先证者母亲（口2、图1）徐某，福州闽侯县人，31岁。2006年第一胎（皿3） 孕20周时因胎动异常于福建省妇幼保健院行彩超检查，发现胎儿肾脏发育异常， 即于孕24周行引产术。2007年第二胎（皿4 ）孕20周在我院行产检，胎儿彩超 检查结果与前次相似，呈双肾肿大及弥漫性囊性改变，并于孕28周早产，生下一 死胎。临床诊断为婴儿型多囊肾。先证者父母均无多囊肾临床症状和体征，
6、祖父生 前30岁左右开始出现肾功能异常，肾功能检查提示有蛋白尿（ + ） ，后发展至 尿毒症死亡，其他家庭成员无类似情况（图1）。1.2先证者父母PKHD1基因突变分析因先证者未留下任何标本，故从其父母及其他成员入手。应用碘化钾法提取先证者 父母全血基因组DNA，参考相关文献PCR引物和扩增条件5,6，分别扩增先证 者父母全血基因组DNA PKHD1基因（NG_008753 ）最长开放阅读框编码区的 66个外显子。PCR总反应体积为25pL:4种dNTP各0.2 mmol/L、10xbuffer 2.5 p L、上下游引物各10 pmol、DNA模板100 ng、TaqDNA聚合酶2.5 U。
7、在PCR扩增仪（ABI, 2720 Thermal Cycler，美国）上完成扩增反应，条件如下: 94C预变性 5 min ;94C变性 30 s ,55C退火 30 s , 72C延伸 45 s,共 30 个 循环；最后一个循环在72C下延伸10 min。PCR产物经纯化后送上海生工测序。1.3先证者父亲第18、59外显子PCR产物酶切鉴定及多态性筛查经Omiga软件分析，先证者父亲外显子18的杂合错义突变（c.1675C T）导致 Mspl酶切位点（CCGG ）消失，正常人存在该酶切位点；外显子59的杂合突变 （C.9901G T ）导致出现新的Mph1103l酶切位点（ATGCAT ）
8、，而正常人无该 酶切位点。故分别用限制性内切酶Mspl、Mph1103l （ Fermentas，加拿大）进 行酶切鉴定。酶切体系参照限制性内切酶说明书：PCR产物10 p L,酶1.5 p L, 酶切体系总体积30 pL;37C酶切2 h后用3%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。同时 对100份正常人外显子18、 59的杂合突变进行酶切鉴定。1.4先证者母亲第53夕卜显子PCR产物 DHPLC的鉴定先证者母亲外显子53杂合缺失经Omiga软件分析后，无酶切位点改变，故用美 国Transgenomic公司WAVE核苷酸片段分析系统（MD-4000 ） DHPLC进行鉴 定。设流速为0.9 mL/min
9、 ,A液41%, B液59%，变性温度为58C。PCR产物 直接上机检测，以经测序无任何碱基改变的正常人外显子53片段的PCR产物作 为对照。1.5 家系调查根据先证者父母表型和已发现的突变，分别针对先证者祖母、伯父的PKHD1基因 夕卜显子18、59片段和外祖父母PKHD1基因的外显子53片段进行序列分析，相 关PCR反应和条件如前。PCR产物纯化后送上海生工测序。2.1 临床诊断及超声检查所见 先证者母亲两次怀孕，胎儿均在围产期死亡。第二胎超声检查示：中孕，羊水极少， 胎儿心内结构未见明显异常，胎儿-胎盘循环功能正常，双肾肿大及弥漫性病变 （婴儿型多囊肾）（图2）。且第一胎彩超结果与第二胎
10、相似。结合两次异常胎产 史和影像学资料，婴儿型多囊肾的临床诊断基本成立。2.2先证者父母PKHD1基因序列分析对先证者父母PKHD1基因66个外显子的PCR产物进行序列测定。结果表明：在 其父外显子18中有一杂合的错义突变：c.1675C T（图3），该突变导致第 559位的精氨酸变为色氨酸；外显子59有一杂合突变：C.9901G T（图3）， 该突变使其编码的第3301位的谷氨酸变为终止密码子。而其母外显子53出现杂 合缺失突变：c.8317delG （图3），该突变使其后的第13个密码子变为终止密 码子。在其父外显子4、36、58以及其父母外显子22中发现如下碱基改变： c.234CT、c
11、.5896CT、c.9492CT、c.2278CT 以及 9 个内含子区碱基改 变（c.527+51GT、c.527+19TC、c.602+67GA、c.2407+50CT、 c.3629-32AG、c.7734-4TC、c.8302 + 12TA、c.8798-19AC、c.8798- 31delT ）和 11 个 SNP。查阅数据库（http:/ www.humgen.rwth-aachen.de ）, 可知c.1675C T已有报道，可能为致病突变；而C.9901G T、c.8317delG未 曾见有相关报道，为国际首报；其余碱基改变均为非致病性改变。2.3 先证者父母基因突变的验证2.
12、3.1酶切证实PKHD1基因外显子18片段大小为237 bp，正常人应用Mspl酶 切后会产生136 bp和101 bp两条片段；外显子59片段大小为301 bp，患者父 亲相应片段PCR产物经Mph1103l酶切后产生135 bp和166 bp两条片段。因 二者皆为杂合突变，故患者父亲等位基因的一半被酶切，另一半则与正常人相同（图 4A、4B）。2.3.2 DHPLC证实先证者母亲外显子53片段经DHPLC分析提前出现洗脱峰，且 有多个不同峰型出现。正常对照只有一个正常的洗脱峰（图4C）。2.4 家系调查及多态性分析先证者祖母（13 ）的PKHD1基因中同时检测到先证者父亲（口3 ）存在的
13、C.1675C T和C.9901G T突变（图3），这说明两个突变位于同一等位基 因，由此可知先证者祖父（14 ）至少一个PKHD1等位基因是正常的；先证者外 祖母（11）检测到与其母亲（口2）相同的PKHD1突变（图3）。同时我们发 现在100份正常人样品中，有2个正常人外显子18片段出现类似先证者父亲（口3）的酶切改变，且结果经测序证实；未见正常人有外显子59的C.9901G T 突变，这说明C.1675C T为多态性碱基改变，而C.9901G T为致病性突变。 多囊肾病（polycystic kidney diseases , PKD ）是一种进展性的遗传性肾病，主 要表现为双肾多囊肿形
14、成和终末期肾病（end-stage renal disease , ESRD ）。在 遗传上，多囊肾主要有显性和隐性两种形式：常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease , ADPKD ）和 ARPKD。其 中 ADPKD 占 PKD 的 95% 98% , ARPKD 占 PKD 的 2% 5%（GeneReview ）。通常ADPKD在成年后出现肝肾相关症状。与ADPKD相比，ARPKD 临床症状更为严重，可导致新生儿死亡、儿童慢性肾病、成人肝脏疾病7 ARPKD常见临床表现为呼吸衰竭、高血压和泌尿道感染，且通常在新生儿期
15、或幼 年时期已十分典型5。部分患者迟至儿童期甚至成年后才有典型多囊肾症状，在 临床上与ADPKD难以区分8,9。目前，ARPKD的诊断依赖于临床发现，尤其是 相关脏器的影像学异常改变（囊性改变，如前影像资料所述）或者是典型病理活组 织检查。针对致病基因PKHD1的分子诊断则可进一步研究其发病的分子机制以及 开展产前诊断10。ARPKD致病基因PKHD1位于6p12，是迄今所知的最大人类基因之一，它长约 470 kb，编码由一系列916 kb大小不等的剪接变异体。最长开放阅读框由66 个外显子组成，编码由4074个氨基酸残基组成的蛋白质（FPC）,分子量为447 kD5。目前，突变数据库中已有报
16、道的突变数已达702个，突变检出率最高达 87%5。突变类型主要有错义突变、截短突变（包括移码突变、无义突变和剪接 位点改变） 11。至今报道的近60%的基因突变是截短突变， 40%则是错义突变12。大多数PKHD1基因突变具有家族特异性，无突变热点，且多数都是复合杂 合突变。所有带两个截短突变的患者都表现为重型ARPKD （致死型），即导致产 前或新生儿期死亡；渡过新生儿期的患者必然带有一个错义突变2,12-19。不少 研究表明，具有相同突变组合的患者的表型有差异，推测这是由于修饰基因和环境 因素的影响18。我科接诊的婴儿型多囊肾家系的先证者母亲怀孕两次，胎儿均在围产期死亡，且彩 超结果均符合多囊肾表现。通过对先证者父母基因序列进行分析，我们在其母PKHD1基因亲外显子5
