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1、高级生物化学实验指导四川农业大学生化研究室 二零一二年十月目录实验一 猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、 同工酶电泳.1实验二 蛋白质分子量测定-凝胶层析法8实验三 纳米磁珠法小规模提取质粒DNA及纯化鉴定18实验四 DNA的琼脂糖凝胶电泳21实验一 猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、 同工酶电泳 一、原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶,他具有抗衰老.抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药化妆品、食品工业等方面具有了广泛地应用前景。 SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶
2、的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈褐色。SOD催化下述反应：2H+2O2-H2O2+O2。机构内0-的过量和不足均对集体不利，SOD对过量的02-的及时清理保证了集体内02-的含量相对平衡。集体内的O2-的形成可病理性和生理性两方面。在一些正常的生理过程中形成一些02-。例如：呼吸链中电子传递结果可以产生一些O2-。在某些疾病的过程产生大量02-如不及时清理，会对细胞损伤。SOD将02-，歧化为H202，而过氧化酶、股胖肝泰过氧化酶可以催化过氧化氢分
3、解，在集体内形成一套解毒系统，对集体起防护作用。本实验采用邮寄溶剂沉淀方法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并惊醒纯化。酶活力测定可用以下方法；邻苯三分自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺自氧化法、亚硝酸法等。该实验sod酶活性采用邻苯三分自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应中，每分钟抑制邻苯三分氧化速率达50%的酶含量定义为一个酶的单位。样品中的蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯蓝G-250Coomassic brilliant blue G-250）在在游离状态下呈紫色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成
4、正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮嗟蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布及活性大小）。二、 实验试剂与器材试剂1. SOD的提取ABC抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml.0.9%NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中。丙酮9
5、5%乙醇氯仿2. SOD活力测定50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液10mmol/L EDTA钠盐溶液3mmol/L 领苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制）3. 考马斯亮蓝G-250法测蛋白质考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。4. SOD同工酶鉴定40%蔗糖w/v：称取40g蔗糖加重
6、蒸水100ml。10%过硫酸铵Ap：称过硫酸铵10g，溶于100ml重蒸水中。用时现配。电极缓冲液：称取三时配羟甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000ml，过滤后装入棕色瓶，4保存。30%的AcrBis溶液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸馏水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4保存。Tris-HCL，ph6.7缓冲溶液：Tris6.0g，加入1mol/L HCL 48ml，TEMED0.4ml,用浓盐酸调PH8.9后，再用蒸馏水定容至100ml。Tris-HCI，PH6.7缓冲溶液：Tris6.0g,加1mol/L HCL 48ml,TEMED0.4m
7、l,用浓盐酸调至PH6.7后，再用蒸馏水定容至100mlNBT溶液：核黄素吗（0.01%），氯化硝基四氮嗟蓝（NBT）（25mol/L），磷酸缓冲液（0.05mol/L）、PH7.8），EDTA-Na2（1.0mol/L）。2.810（3）mol/L的EDTA-Na2（用PH7.8/,3.610（3）moL/L磷酸缓冲液配制）器材752分光光度计；分析天平；具塞试管；刻度吸管；（1ml，5ml）；离心机；烧杯（50ml）电泳装置一套；微量进样器；注射器。 三、操作步骤1. SOD的提取 1取新鲜猪血20ml（预先0.15:1（v/v）的比例加入ACD抗凝剂），4000r/m，10min，去上层
8、血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%Nacl溶液重复清洗一次，4000r/m，10min,得洗净的红血球浓稠液。2向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。将上层液用多层纱布进行粗滤，以除去上层液中的漂浮物，然后将清夜在65-70恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至
9、室温，4000r/m，15min除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。3向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过液，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。2.SOD活力测定 1邻苯三酚自氧化率的测定 取405ml50mol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25水浴保温20min，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mol/L HCI作空白，325nm波长下每隔3
10、0秒测光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化氯控制在0.070/min左右。 2酶活力测定 操作与1一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1ml的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酸后邻苯三酚自氧化氯。 3酶活性单位的计算 根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性： (A0-Am)/A0*100% 样液稀释倍数单位活性（U/ml）=-*反应液总体积数*- 50% 样液体积 其中，A0为邻苯三酚自氧化氯；Am为加酶后邻苯三酚自氧化氯。 总结性（U）=单位活性*酶原液总体积 4蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250
11、法） 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂： 管 号 试 剂 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250(ml) 5 5 5 5 5 5蛋白质含量（ug） 0 20 40 60 80 100 塞上盖子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测定光密度值，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白质含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标注曲线。 样品中蛋白质含量的测定 将待测的SOD溶解并解释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提
12、取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。 蛋白质含量计算 根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查到相应的蛋白质含量，计算其浓度。 5结果处理 利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。 单位活力（U/ml） 总活力 比活力（U/mg）=- = - 单位蛋白质浓度（mg/ml） 总蛋白质（mg） 将测定的数据或计算结果填入下表：提纯步骤 酶液总体积 蛋白质 酶活性 总活性 比活性 回收率 纯化倍数 ml mg/ml U/ml U U/mg % 除血蛋白血清热变性后上清丙酮沉淀后的3.SOD同工酶鉴定（PAGE） 1样品制备 取一定
13、浓度（约SOD0.5mg/ml）酶液，按酶液：40%蔗糖=1：1（V: V）的比例配成样品液，备用。 2上样及电泳 组成电泳槽：将四只固定螺杆插入一只贮槽的相应空洞中，然后将贮槽框放在桌上。左手拿凹形带槽橡胶模框，右手的拇指与中指握住短玻璃板的两侧边缘插到橡胶模框的短槽内，然后以同样方式将长玻璃极插到相应的长槽内，将带有长、短玻璃板的橡胶模框平放在仰放的贮槽框架上，其下缘必须对齐贮槽框下缘。双手拿另一只贮槽框仰放在桌上的贮框相会，并使橡胶模框上的凸出线位于贮槽的有机玻璃框的中央。装上四只螺母。拧紧螺丝。最好用双手按斜角位置双双逐渐拧紧。将电泳槽垂直置起，放在桌上，带短玻璃板的贮槽称上槽，带长玻璃板的贮槽称下槽，在长玻璃板与胶模框间有一缝隙。此缝隙可用已溶化的1%琼脂沿长玻璃板下端灌入，以防止产生气泡。待琼脂完全凝固后才能灌胶。1凝胶的制备
