《基因工程笔记》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程笔记（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1.什么叫基因工程（Gene Engineering）,试从理论和技术两个方面谈谈Gene Engineering 诞生的基础？基因工程:在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合， 并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。理论基础：1944年，美国生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体， 即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；1953年Watson和Crick建立了 DNA分子的双螺旋结构模型，1958年至1972年揭示 了先后确立了中心法则，破译了 64种密码子技术基础：20世纪60年代末70年
2、代初，限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现使DNA 分子进行体外的切割和连接成为可能； 1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子如何进入宿主细 胞，并在其中进行复制和有效表达等问题。经研究发现，质粒分子是承载外源DNA片段的 理想载体，病毒，噬菌体的DNA（或RNA）也可改造成载体 1973年大肠杆菌转化体系的建立，这实验结果说明基因工程问世，不仅宣告质粒分子 可作为基因克隆载体，能携带外源DNA导入宿主细胞，并且证实真核生物基因可转移到原 核生物细胞中，并在其中实现功能的表达（基因工程诞生的元年）克隆：作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式
3、产生的具有 相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产 生上述集体或群体的过程。质粒小量提取中，溶液I、ii、m作用是什么？溶液I是使细胞完全分散溶液II是使细胞壁破裂，DNA变性溶液m是使质粒选择性复性， 而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下来限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种 特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism限制片段长度多态性：指用某一种限制性 内切酶来切
4、割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，会得到不同长度的DNA片段。可 用于基因组图谱构建、致病基因检测、基因定位、生物进化和分类的研究等限制性图谱（restriction map）:是指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和 它们之间的相对位置。又称物理图谱（physical map）核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅ATP、Mg2+ 和Mg2+ATP、Mg2+和 SAM助因子SAM寄主特异性位点识别Eco
5、B:回文序列EcoP1:序列TGA(N)8TGCT（IIs型除外）AGACCEcoK:EcoP15:CAGCAGAAC(N)6GTGC切割位点在距离识别位点至少位于寄主特异性位点或其距寄主特异性位点1000 bp处随机切开一-附近3端 2426bp 处条单链。酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列能能能进行切割序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用常用的DNA聚合酶的特点共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3一OH端。主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。2 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNT
6、Ps 而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离 下来。3.常用DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶3t5外切酶活性5，t3外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高Taq聚合酶：TaqDN聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。最 适温度高75-80 oC功能缺点，具有5 3聚合酶活性和5 3外切酶活性，但没有3
7、5 外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！Taq DNA聚合酶的激活剂金属离子敏感(尤其 是 Mg2+末端脱氧核苷酸转移酶(terminal transferase)：特性：(1) 5 3 DNA聚合酶活性 需要3OH、二甲脾酸缓冲液。 不需要模板！ 底物可以是单链DNA、是3 OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效 地连接。（2）再生酶切位点，便于回收克隆片断。（3）非放射性标记DNA片断的3端催化非放射性标记物参
8、入DNA片断的3端。（生物素-11-dUTP 等）S1核酸酶：特性（1）高度单链特异性（2）反应条件：低水平Zn2+，pH4.04.3、S1核酸内切酶的功能（1）催化单链RNA或DNA降解。（2）切掉双链核酸中的单链区。发卡或有缺口的部位。3）降解限制酶切形成的单链突出端。（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链.S1核酸酶的用途（1）定位RNA内切酶位点不能位于内含子序列中！（2）用mRNA测定基因中的外显子序列不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。pBR322 : F. Bolivar和 R.L. Rodriguez 人工构建载体。(1) 元件来源 复制起点ori pMB1系列
9、(来源于ColEl)的高拷贝型复制起点 Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr基因。(2) 长度(3) 选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。(4) 克隆位点24个克隆位点。其中9个会导致Tetr基因失活(如BamH I、Hind III、Sal I)3个会导致Ampr基因失活(Sca I、PvuI、Pst I)。见图P93(5) pBR322的优点 双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamHI : Amp中存活，但在Tet中死亡外源基因
10、Pst I： Tet中存活，但在Amp中死亡 分子小，克隆能力妆体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全失去了转移蛋白基因mob (mobilization)o不能通过接合转移。(6) pBR322的缺点保留了转移蛋白(mob)的作用位点。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！(7) PBR322的改进 删除mob识别位点(如质粒pBR327、pAT153等)。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断， 既除去了 mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。 改造EcoR I位点
11、pBR325:使EcoRI也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断(带有氯霉素抗性基因cmlr)。cmlr上也带一个EcoRI位点。pUC系列University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于 1978 年，在 pBR322 的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19(3) 元件来源 复制起点：pBR322的ori Ampr基因pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。 lacZ的启动子：大肠杆菌 lacZ基因：大肠杆菌l
12、acZ的a-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。(2) 长度约2.7kb(3) 克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端Ti质粒：存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒(tumor inducing plasmid)-T-DNA 区域 细胞分裂素基因virTi质粒布边界建制起始位点天然Ti质粒作载体的缺点（1）分子量太大（200kb）!（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。.Ti质粒的改造（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。（2）减少限制性酶切位点，引入单一
13、插入位点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。（4）冠瘦碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。改造后的Ti质粒载体模式双元质粒载体和共整合载体应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）:在体外特异性地扩增某个基因。可用于目的基因的扩增和分离Primer设计的一般原则:1位置：与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5 端相同）的短DNA2引物长度至少16bp, 一般引物设计为长1530bp3引物的碱基序列3 端必须与
14、模板正确配对，5端可以不配对4引物的碱基组成1）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力2）避免连续相 同碱基排列或内部回文序列.5 避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补6当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。实际复性温度选择低于Tm 值5oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现7引物的浓度一般使用终浓度各0.5mmol/L8简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密 码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混 合引物称简并引物9套嵌引物（nested primers）设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加 扩增产物的特异性。PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸1）DNA模板变性95oC双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为 单链。（2）DNA模板与引物复性40-65oC引物（primer）:人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双 链的5 端相同。（3）DNA链的延伸72oC DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链
