革兰氏染色

《革兰氏染色》由会员分享，可在线阅读，更多相关《革兰氏染色（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,884年由丹麦医师Gram创立。细菌先经碱性染料结晶染色,而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类,前者叫做革兰氏阳性菌（+),后者为革兰氏阴性菌（G)。为观测以便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色,阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌,以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反映;弧菌,螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反映。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学构成和生理性质上有诸多差别，染色反映不同样。目前一般觉得革兰氏阳性菌体内具有特殊的核蛋白质镁盐

2、与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合限度底,吸附染料差,易脱色，这是染色反映的重要根据。此外,阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相似P条件下进行染色,阳性菌吸附碱性染料诸多，因此不易脱去，阴性菌则相反。因此染色时的条件要严格控制。例如,在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多,都可呈正反映;PH很低时,则可都呈负反映。此外,两类菌的细胞壁等对结晶紫碘复合物的通透性也不一致,阳性菌透性小,故不易被脱色，阴性菌透性大,易脱色。因此脱色时间，脱色措施也应严格控制。革兰氏染色法一般涉及初染、媒染、脱色、复染等四个环节,具体操作措施是：1)涂片固定。2)草酸铵结

3、晶紫染1分钟。3)自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加9%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色,3秒后水洗，吸去水分。)蕃红梁色液（稀）染1秒钟后，自来水冲洗。干燥,镜检。染色的成果，革兰氏正反映菌体都呈紫色,负反映菌体都呈红色。一、常用染色液的配制 碘-碘化钾(2-K)溶液 能将淀粉染成蓝紫色,蛋白质染成黄色，也是植物组织化学测定的重要试剂。配方：碘化钾2 ；蒸馏水300ml;碘g 先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,待全溶解后再加碘,振荡溶解后稀释至00mL,保存在棕色玻璃瓶内。用时可将其稀释2-10倍,这样染色不致过深，效果更佳。 苏丹（sudan或） 能使木栓化、

4、角质化的细胞壁及脂肪、挥发油、树脂等染成红色或淡红色,是出名的脂肪染色剂。 配方:(）苏丹III或苏丹干粉.g ； 5%酒精0ml ；过滤后再加入1ml甘油（2）先将0.1g苏丹III或V溶解在50l丙酮中，再加入酒精50m。(）苏丹III 70乙醇的饱和溶液。 1醋酸洋红（acetoarmne） 酸性染料,合用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。 配方:洋红g ; 5醋酸10ml 煮沸2h左右,并随时注意补充加入蒸馏水到原含量,然后冷却过滤，加入4铁明矾溶液12滴(不能多加，否则会发生沉淀）,放入棕色瓶中备用。 改良苯芬品红染色液（Carbol uchne）核染色剂。配制环

5、节: 先配成三种原液,再配成染色液。 原液A:g碱性品红溶于100ml 酒精中。 原液：取原液1m加入到90l5石炭酸水溶液中。 原液:取原液B 5m，加入ml冰醋酸和6l福尔马林(38%的甲醛）。 (原液A和原液C可长期保存,原液B限两周内使用）染色液:取C液100ml，加5冰醋酸800ml,再加山梨醇1.8g,配成1%20%浓度的石炭酸品红液,放置两周后使用,效果明显(若立即用,则着色能力差)。 合用范畴：合用于植物组织压片法和涂片法，染色体着色深，保存性好，使用年不变质。山梨醇为助渗剂,兼有稳定染色液的作用,如果没有山梨醇也能染色,但效果较差。 中性红(neutral red)溶液 用于

6、染细胞中的液泡,可鉴定细胞死活。 配方:中性红0.1g ； 蒸馏水10ml 使用时再稀释0倍左右。 曙红Y(伊红,osin Y）酒精溶液 常与苏木精对染,能使细胞质染成浅红色,起衬染作用。 配方:曙红025 ；95%酒清100l 也常用于9酒精脱水时，加入少量曙红溶液,其目的是在包埋、切片、展片、镜检时便于辨认材料。 钌红(rueium d）染液钌红是细胞胞间层专性染料，其配后不易保存,应现用现配。配方:钌红510m ; 蒸馏水2550ml 龙胆紫（gentia ile）为酸性染料,合用于细菌涂抹制片。配方:龙胆紫01 ； 蒸馏水00ml 苯胺兰（anlie lue）溶液 为酸性染料，对纤维素

7、细胞壁、非染色质的构造、鞭毛等,特别是染丝状藻类效果好。还多用于与真曙红作双重染色,对于高等植物多用于与番红作双重染色。配方：苯胺兰1 ; 5%或95酒精10ml 间苯三酚(phloroglucin）溶液用于测定木质素。 配方:间苯三酚g； 95%酒精100ml 注:此溶液呈黄褐色即失效。 橘红(rageG)酒精溶液 为酸性染料,染细胞质,常作二重或三重染色用。 配方:橘红G 1g ; 9酒精100m 番红(aannO） 为碱性染料，合用于染木化、角化、栓化的细胞壁，对细胞核中染色质、染色体和花粉外壁等都可染成鲜艳的红色。并能与固绿、苯胺兰等作双重染色，与橘红G、结晶紫作三重染色。配方:(1）

8、番红水溶液 番红0.或1 g ;蒸馏水100ml （2）番红酒精溶液 番红0.5或1 ；0(或9)酒精10ml(）苯胺番红酒精染色液甲液番红 g +95酒精l 乙液 苯胺油0ml 蒸馏水50ml 将甲、乙二溶液混合后充足摇均匀，过滤后使用。 固绿（st reen） 又称快绿溶液。为酸性染料，能将细胞质，纤维素细胞壁染成鲜艳绿色，着色不久,故要较好的掌握着色时间。 配方:(）固绿酒精液 固绿0.1 g； 95%酒精100m（)苯胺固绿酒精液固绿 1 ;无水酒精 100ml；苯胺油4ml配后充足摇匀，过滤后使用。现配现用效果好。 苏木精(etoyli)染液 苏木精是植物组织制片中应用最广的染料，是

9、苏木科植物苏木的心材提取出来的。它是很强的细胞核染料，并且可以分化出不同颜色。配方诸多,现举海登汉氏(Hienhis)苏木精染色液,又称铁矾苏木精染色液。配方：甲液（媒染剂）： 硫酸铁铵(铁明矾)2g ；蒸馏水0ml (必须保持新鲜，最佳临用之前配制） 乙液(染色剂）：苏木精 05g ；9酒精 0；蒸馏水 9ml 配制环节:（1）将苏木精溶于酒精中,瓶口用双层纱布包扎，使其充足氧化（一般在室内放置两个月后方可使用)。()加入蒸馏水,塞紧瓶口，置冰箱中可长期保存。 切片需先经甲液媒染，并充足水洗后才干以乙液染色,染色后经水稍洗再用另一瓶甲液分色至适度。 铁矾苏木精染液为细胞学上染细胞核内染色质最

10、佳的染色剂,但要注意甲液与乙液在任何状况下决不能混合。 亚甲基蓝染液 常用于细菌、活体细胞等的染色。 取0.1亚甲基蓝,溶于0m蒸馏水中即成。 詹纳斯绿B（Janugree B）染液 将5.18gJanus绿溶于100l蒸馏水，配成饱和水溶液。用时需稀释。稀释的倍数应视材料不同而异。 硫堇染液 取.2克硫堇(也称劳氏青莲或劳氏紫)粉末,溶于100ml蒸馏水中，即可使用。使用此液时,需要用微碱性自来水封片或用1%aHO3水溶液封片，能成多色反映。 1.黑色素液 水溶性黑素，蒸馏水100,甲醛(福尔马林).L。可用作荚膜的背景染色。19墨汁染色液国产绘图墨汁4mL,甘油2mL,液体石炭酸2m。先将

11、墨汁用多层纱布过滤，加甘油混匀后，水浴加热,再加石炭酸搅匀，冷却后备用。用作荚膜的背景染色。 0.吕氏（Loeffier）美蓝染色液A液：美蓝(thyene ue,又名甲烯蓝)0.3g,9乙醇3mL; B液:0.01H00mL。 混合液和B液即成，用于细菌单染色,可长期保存。根据需要可配制成稀释美蓝液,按10或1100稀释均可。1革兰氏染色液 (1)结晶紫(rital vole）液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL9%乙醇中)2L，1%草酸铵水溶液80。将两液混匀置24h后过滤即成。此液不易保存，如有沉淀浮现，需重新配制。 (2)芦戈(Lgol)氏碘液:碘1g，KI 2g，蒸馏水300

12、m。先将KI溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300mL，即成。配成后贮于棕色瓶内备用,如变为浅黄色 能使用。 (3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用如下（4)或（5)的其中一项复染即可。 (4)稀释石炭酸复红溶液:碱性复红乙醇饱液(碱性复红1g，95%乙醇0L，5%石炭酸0mL)10mL,加蒸馏水90m。 (5)番红溶液：番红O(safranie O，又称沙黄O）2.5g，95乙醇00mL,溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中,用时取20mL与80m蒸馏水混匀即可。 以上染色液配合使用，可辨别出革兰氏染色阳性(G+)或阴性(- ）细菌，前者蓝紫色，后者淡红色。 22.齐氏（Zi

13、ehl)石炭酸复红液:碱性复红0.3g溶于95%乙醇0mL中为液；.01%OH溶液0L为B液。混合、B液即成。 23姬姆萨(imsa)染液(1）贮存液：称取姬姆萨粉0.5g,甘油3mL,甲醇33mL。先将姬姆萨粉研细，再逐滴加入甘油，继续研磨，最后加入甲醇,在56放置1-24h后即可使用。 (2)应用液(临用时配制)：取1L贮存液加1mpH7.磷酸缓冲液即成。也可以贮存液甲醇1的比例配制成染色液。4. 1%瑞氏(Wrights)染色液 称取瑞氏染色粉6g,放研钵内磨细，不断滴加甲醇(共60mL）并继续研磨使溶解。通过滤后染液须贮存一年以上才可使用，保存时间愈久，则染色色泽愈佳。 二、常用试剂的

14、配制(一）显微镜镜头清洁剂将乙醚和乙醇按7混合,装入滴瓶备用。用于擦拭显微镜镜头上油迹和污垢等(注意瓶口必须塞紧，以免挥发)。 (二）固定液 1.福尔马林乙酸酒精固定液(FAA，又称万能固定剂） 福尔马林(3甲醛)5l冰乙酸5ml70酒精90 ml，可用于固定植物的一般组织,但不合用于单细胞及丝状藻类。幼嫩材料用50酒精替代0%酒精,可避免材料收缩；还可加入l甘油（丙三醇）以防蒸发和材料变硬。FAA 可兼作保存剂。2.福尔马林-丙酸-酒精固定液（FA）福尔马林5丙酸5m+70酒精9ml，用于固定一般的植物材料,一般固定24h，效果比A 好,并可长期保存。 3.福尔马林-丙酸氯仿固定液(卡诺固定液） 配方一：无水酒精3份冰乙酸1份。 配方二：无水酒精份冰乙酸份氯仿3份。 是研究植物细胞分裂和染色的优良固定液，材料固定后，用95和85的酒精浸洗，清洗-3次,也可转入0%酒精中保存备用。 4甘油-酒精软化剂 甘油1份0%或70酒精1份,合用于木材的软化,将木质化根、茎等材料排除空气后浸入软化液中,时间至少一周或更长某些，也可将材料保存于其中备用。 .铬酸乙酸固定液 根据固定对象的不同，可分强、中、弱3种