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1、荧光抗体技术抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。免疫荧光免疫荧光测定抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法荧光物质1) 荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并 能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末，易 溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4,最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长 520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异
2、构体I型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好， 在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏 感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明(rhodamine，RIB200)为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙 酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC)结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠 绿色荧光对比鲜明，可配
3、合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光 效率较低。其他荧光物质1) 酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强 荧光的物质。例如4-甲基伞酮-8-D半乳糖苷受8-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后 者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4- 甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的 螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间
4、长，最适合用于分辨荧 光免疫测定。免疫荧光常见荧光编辑免疫荧光荧光素1）FITC2）RB2003）TRITC4）镧系：Eu、Tb5）PE6）其它常见荧光素的特性1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490495nm，发射光：520530nm，明亮的黄绿色 火光。2）RB200：橘红色粉末，吸收光570nm，发射光595600nm，橘红色荧光。3）TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。4）镧系：Eu、Tb5）PE:吸收光490560nm，发射光595nm，红色荧光。6）其它：酶作用后产生荧光物质。免疫荧光酶作用生物质酶底物产物激发光发射光B-G MUG MU 360
5、 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚体 317 414合适荧光素的选择1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光素-N=C +NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质II I I II IS H H SH2）荧光效率高，标记后下降不明显。3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。4）标记后能保持生物学活性和免疫活性5）标记方法简单、快速。6）安全无毒1免疫荧光实验步骤编辑免疫荧光直接法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高， 非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。 此法常用于细菌、病毒等微
6、生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）： 0.01mol/L, pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L, pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37C温箱等。实验步骤 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定 湿度。 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保 温
7、一定时间（参考：30min）。 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆 盖。 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用+”表示：（-）无荧光；（士）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮; （+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照显示为（士） 或（-），即可判定为阳性。注意事项1）对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度
8、，一般稀释度不应超过 1： 20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2）染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25C左右），高于37C可加强染色 效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2C的低温，延长染色时间。 低温染色过夜较37C30 min效果好的多。3）为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧 光染色的干扰。 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性
9、抗体，再加荧光标记的特异性抗 体。 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧 光，则为特异性阳性染色。4）一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好 在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。免疫荧光间接法测抗体基本原理染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上， 在湿盒中37C保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步， 加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记 的抗球
10、蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）： 0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37C温箱等。实验步骤1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持 一定湿度。2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。 将玻片置于有盖搪瓷盒内，37C保温30
11、min。3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺 序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标 记的抗人球蛋白抗体。5）将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37C保温30min。6）重复操作3。7）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片8）荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。注意事项1）荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h，时间过长，会使荧光减弱。2）每次试验时，需设置以下三种对照：阳性对照：阳性血清+荧光标记物阴性对照：阴性血清+荧光标记物荧光标记物对照：PBS+荧光标记物3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4, 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放 置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
