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1、权利要求书1. 一种连接融合蛋白 X 和阳离子抗菌肽的方法，其特征在于该连接产物具有以下核苷 酸序列：a. SEQ ID:NO 1;b. SEQ ID:NO 2.2. 如权利 1 所述连接产物，其特征在于其编码的氨基酸序列：a. SEQ ID:NO 3.b. SEQ ID:NO 4.3. 如权利1,2所述PCR产物，其特征在于利用T4 DNA连接酶将1,2直接平末端连接, 且利用融合蛋白的负电荷抑制阳离子抗菌肽的毒性。4. 如权利 1,2,3 所述的连接片段，其特征在于目的抗菌肽前含有酸水解位点，有利于 融合蛋白的分离纯化。5. 如权利 1,2,3,4 所述的大肠杆菌基因工程菌及其重组质粒,其
2、特征在于生产阳离子抗 菌肽中的应用。说明书一种连接融合蛋白和阳离子抗菌肽的简便方法技术领域本发明属于基因工程领域，涉及使用平末端连接，将融合蛋白基因与阳离子抗菌肽基 因连接，连接产物插入相应质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，生产抗菌肽。背景技术DNA 末端连接有粘性末端和平末端两种，因为粘性末端具有较高的连接效率，通常情 况下使用前者。但对于任意 DNA 片段的互相拼接中，平末端则具有简便易行，使用广泛的 特点。在分子生物学的研究中，外源 DNA 片段的连接相当常见。对于较长片段的拼接目前多 使用重叠PCR的方法，需要设计较多引物，进行多次PCR反应，有时因为退火温度的差异 给实验带来不便
3、，增加工作量。这时我们可以考虑使用平末端连接方法，在两个片段引物 的 5端设计相应的酶切位点和保护碱基，得到 PCR 产物后，在较低退火温度下用 T4 DNA 连接酶进行连接反应，会得到大小不等几个条带，只需回收目的产物预期大小的片段即可。 对于多个片段相互拼接，平末端连接的简便优势则会更加明显。阳离子抗菌肽( cationic antimicrobial peptides, AMPs )是在诱导条件下 , 生物 体免疫系统产生的带净正电荷的两性小分子活性肽类。阳离子抗菌肽通过与细胞膜上的阴 离子相互作用，破坏膜结构，形成离子通道使胞质外泄，继而细菌裂解死亡，这种独特的 杀菌机制不易产生耐药性
4、菌株。采取融合表达的策略，即利用各种带净负电荷的融合蛋白 来抑制目的抗菌肽对宿主细胞的毒性，而在诱导表达后，再用相关切割方法去除融合蛋白， 恢复活性。这样既能得到较大的表达产量，且以较低的纯化成本得到具有生物活性的抗菌 肽。发明内容本发明设计一种融合蛋白，带有较多的负电荷。将抗菌肽基因拼接到融合头基因的下 游，得到连接产物，插入分泌表达质粒，转化大肠杆菌表达。该融合头产生以下效果：2. 抑制抗菌肽对宿主细胞的毒性；2. 在融合蛋白 C 端具有酸水解位点，有利于以低成本方 法去除融合头；3. 融合蛋白分泌出胞表达，避免包涵体形成，便于纯化。本发明的技术方案为：一种融合蛋白和阳离子抗菌肽的平末端连
5、接方法，其特征在于含有下列核苷酸序列：a. SEQ ID:NO 1;b. SEQ ID:NO 2.如权利1,2,3所述DNA片段，其特征在利用融合蛋白X增强表达的稳定性，且该片段 的负电荷可抑制阳离子抗菌肽的毒性。如权利 1 , 2 , 4所述连接片段，其特征在于它的表达产物在融合蛋白和抗菌肽之间有酸 水解位点(DP)，有利于G13的分离纯化，便于工业化生产。如权利 1,2,5 所述大肠杆菌重组质粒,其特征在于分泌出胞表达，可应用于制备阳离 子抗菌肽。技术方案所依据的科学原理：阳离子抗菌肽的正电荷对于其生物学活性是必需的，它们有助于抗菌肽分子与靶标例 如细菌细胞膜或核酸分子的结合。利用融合表达
6、，融合头中的酸性氨基酸可以抑制目的抗 菌肽对宿主细胞的毒性；添加酸水解位点，可以采用成本极低的化学方法去除融合蛋白； 分泌出胞表达，省略了破碎细胞的步骤，避免了内毒素等细胞内含物的释放，有利于下游 分离纯化。技术效果1稳定表达：带有净负电荷的融合蛋白抑制抗菌肽对宿主的毒性，使得融合蛋白能 稳定的表达。2. 融合蛋白分泌出胞表达，细胞内基本无目的产物。3酸水解位点的引入使得以低成本方式酸解得到目的产物成为可能。 具体实施方式1、基因扩增：根据密码子偏好合成抗菌肽基因，下游引物添加酶切位点及保护碱基； 融合蛋白上游引物添加酶切位点及保护碱基，使用PCR技术进行扩增两个片段。2、平末端连接，T4DN
7、A连接酶连接两个PCR产物，添加聚乙二醇(PEG4000 )提高连 接效率。3、目的片度获取：双酶切连接产物，胶回收目的片段预期大小的琼脂糖电泳条带。4、克隆与转化：目的片段与双酶切后的质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞。5、诱导表达：筛选正确的克隆，振荡培养基因工程菌至对数生长期，然后加入诱导 剂诱导。6、分离纯化：取诱导上清液酸水解，用阳离子交换树脂吸附，洗脱得到阳离子抗菌 肽。二、实施例以合成的抗菌肽 G13 序列为模板，上游引物加入 DP 氨基酸序列，下游引物加入终止 密码子和EcoR I酶切位点及保护碱基。引物如下：G13F: 5-GATCCGCAGCGTTCTG-3； G13R: 5
8、-GGAATTCTTACGGATC-3 反应条件:95C 5min, 94C 30s, 55C 30s, 72C 30s, 25个循环，72C 10min。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳检测，试剂盒回收G13片段。以保存的带有融合蛋白X的质粒为模板，上游引物加入Nco I酶切位点及保护碱基。 引物如下: XF: 5-CCCATGGATGGCAGAACAAAGC-3, XR: 5-AAGGGTTTCCGAAGG CTTGGC-3反应条件：95 C 5min, 94C 30s, 60C 30s, 72C 30s, 25 个循环，72C 10min。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测，试剂盒回收X片段。
9、G13片段和X片段用T4 DNA连接酶进行平末端连接。连接条件：两片段各5卩L, 1 0 x ligation buffer 2yL, 50%PEG4000 solution 2 L, T4 DNA Ligase 1yL, ddH2O 5 yL。22C连接1h, 65C 10min失活酶。1%琼脂糖电泳检测，切胶回收目的片段。用X上游引物和G13下游引物扩增连接片段X-G13, Nco I和EcoR I双酶切，条件 如下：PCR 产物 10 jL, 10 x buffer Tango 4 y L，内切酶各 1.5 yL, ddH2O 13 yLo 37 摄 氏度孵育4h, 65C热失活20mi
10、n。酶切产物经由试剂盒纯化后连接载体。转化大肠杆菌B L21(DE3)感受态，涂LB ( Amp + )平板，挑单克隆菌落PCR验证，测序。同时用终浓度 1mmol 的 IPTG 诱导表达蛋白。SEQ ID:NO 1XSEQ ID:NO 2 GATCCGCAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGGTAA SEQ ID:NO 3 融合蛋白SEQ ID:NO 4DPQRSVSNAATRVCRTGRSRW说明书摘要本发明公开了一种利用平末端连接融合蛋白和抗菌肽基因方法。在构建表达质粒时， 选用一段旨在抑制阳离子抗菌毒性且能增加表达产量及稳定性的融合头，与目的基因拼 接。融合蛋白以分泌表达可溶形式存在于诱导培养基中。在融合头与目的抗菌肽之间加入 酸水解位点，收集上清直接用低pH条件分离抗菌肽，方法简便易行。
