实验蛋白质的沉淀反应和颜色反应

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1、实验 蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原和方法。 熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步 熟悉蛋白质的有关反应。二、实验原 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。同 的蛋白质由于所含的氨基酸完全相同， 颜色反应亦完全相同。 颜 色反应是蛋白质的专一反应， 一些非蛋白物质也可产生同样的颜色 反应，因此能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。 另 外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定测定的依据。 蛋白质是亲 水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但 其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生变化，破坏蛋白质 的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。三

2、、实验仪器1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH 试纸 6、水浴 锅 7 、移液管四、实验试剂1、清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释 10-20 倍，3-4 层纱布过 滤，滤液放在冰箱藏备用。2、0.5%苯酚：lg苯酚加蒸馏水稀释至200ml。3、 Millons 试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶） 溶解后，却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂 可长期保存。4、素晶体5、1%CuSO ： 1g CuSO 晶体溶于蒸馏水，稀释至 100ml446、10%NaOH : 10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8 0 1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于9

3、5%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓酸11、 饱和酸铵溶液：100ml蒸馏水中加酸铵至饱和。12 、酸铵晶体：用研钵研成碎末。13、95%乙醇。14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15 、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至 100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。18、1%醋酸溶液。五、实验步骤蛋白质的颜色反应（一）米伦（Millons）反应1、苯酚实验：取 0.5%苯酚溶液 1ml 于试管中，加 Millons 试 剂 0.5ml ，电炉小心加热观察颜色变化。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Mil

4、lons 试剂0.5ml，出 现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。（二）双缩脲反应1、取少素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新 结晶时却。然后加 10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4 溶液，混匀，观察现象。2、取蛋白液1ml，加 10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察现象。（三）黄色反应取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，观察颜色有么变化。（四）茚三酮反应取蛋白液 1ml 于试管中，加 4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有 蓝紫色出现。蛋白质的沉淀（一）蛋白质

5、的盐析作用1、试管中加蒸馏水3ml，加固体酸铵至饱和。另一支试管加 蛋白液2ml，再加入饱和酸铵溶液2ml，摇匀静置观察现象。2 、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少固体酸铵，直 至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少蒸馏水，观察沉淀是否 溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质试管中加蛋白液1ml加晶体氯化钠少许溶解后加95%乙醇3ml, 摇匀，观察现象。（三）重属盐与某些有机酸沉淀蛋白质1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液， 另一支管中滴加 1%酸铜溶液，至有沉淀产生。2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混 匀，观察结果。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质

6、 取一支试管，加入蛋白液 2ml 及醋酸 4-5 滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。、实验结果蛋白质的颜色反应（一）米伦（Millons）反应1 、苯酚实验： 溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验： 出现白色的蛋白质沉淀，小心加热后凝固的蛋白质出现红色。（二）双缩脲反应1、有紫色出现。2、溶液有蓝紫色出现（三）黄色反应先有黄色沉淀生成，加入 10%NaOH 溶液 1ml 后颜色变为橘黄色。（四）茚三酮反应有蓝紫色出现。蛋白质的沉淀（一）蛋白质的盐析作用1、有蛋白析出。2、有蛋白质析出，加水后可复溶。（）有机溶剂沉淀蛋白质取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇

7、匀，观察现象（七）重属盐与某些有机酸沉淀蛋白质取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液， 另一支管中滴加 1%酸铜溶液，至有沉淀产生。（八）生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液 2ml 及醋酸 4-5 滴，再加饱和苦味酸和 鞣酸数滴，观察现象。七、 实验分析蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。同的蛋白质由于所含的氨基酸完全相同， 颜色反应亦完全相同。其中米伦试剂能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应，而组成蛋 白质的氨基酸中氨酸含苯酚基团， 因此可用米伦试剂检测蛋白质中 氨酸的存在。素被加热，形成双缩脲，在碱性环境中，能与酸 铜结合成紫色的化合物，此反应称

8、为双缩脲反应。蛋白质分子中含有 肽键与缩脲结构相似，也能进此反应。 蛋白质分子中含有苯环结构 的氨基酸（如氨酸、 色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质， 此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。蛋白质与 茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反 应为-蛋白质及 a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸） 与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水 化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生变化， 破坏蛋白质的稳定性， 蛋白质就会从溶液中沉淀出来。向蛋白质中 加入大的中性盐（酸铵、酸

9、钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗 脱水， 破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相 反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析 作用一般使蛋白质变性。 某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等）， 因引起蛋白质脱去水化层以及低介电常数而增加带电质点间的相 互作用，致使蛋白质颗容凝聚而沉淀。 重属离子 （如 Pb2+、Cu2+ 等）与蛋白质的羧基等结合生成溶性的属盐类而沉淀， 同时蛋白 质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。 植物体内具有显著生作用的含氮碱性化合物成为生物碱。 能沉淀生 物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液 PH

10、 小于等电点时，蛋白质颗带正电荷，容与生物碱试剂的负离 子发生反应而沉淀。蛋白 质变性(protein denaturation)是指蛋白质在某些 物和化学因素作用下其特定的空间构象被改变， 从而导致其化性 质的改变和生物活性的丧失。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构 有改变或遭到破坏， 是变性的结果。 能使蛋白质变性的化学方法 有加强酸、强碱、重属盐、素、乙醇、丙酮等；能使蛋白质变性 的物方法有加热(高温)、紫外线及X射线照射、超声波、剧振荡 或搅拌等。如果变性条件剧持久， 蛋白质的变性是可逆的。 如果变性条 件剧，这种变性作用是可逆的。这时，如果除去变性因素，在适 当条件下变性蛋白质可恢复

11、其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋 白质复性( rena tura tion)。如胃蛋白酶加热至 8090C时，失 去溶解性，也无消化蛋白质的能，如将温再低到37C，则又可恢复溶解性和消化蛋白质的能。蛋白质变性的应用价值 医学：临床上的消毒和灭菌-使病原微生物变性注射及外伤采用 75%乙醇灭菌手术器械及其它用品采用高温高压灭菌手术室用紫外线灭菌用热凝法检查蛋白实验室：防止蛋白质变性：在生产和保存激素、酶、抗体血清等具有生物 活性的蛋白质(如酶、疫苗、免疫血清等)时，应防止其变性失活， 其中在低温条件下生产与贮存以上蛋白质就是这个道。实验室的灭菌：细胞培养室等亦用紫外线照射消毒灭菌。 日常生活

12、：熟食较生食消化： 因为蛋白质变性后，肽链构象由卷曲变为伸展， 使肽健，被蛋白水解酶消化水解。其中盐析法作为一种蛋白质胶体简的提取手段被广泛应用于 工业生产。- - 丿盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓 ,或达饱和状 态,使某些成分在水中溶解低,从而与水溶性大的杂质分离。如向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐如(NH4)2S04或Na2S04 溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。 这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而影响原来蛋白质的性质。 因此，盐析是一个可逆的过程。用这个性质，可以采用多次盐析的 方法来分离、提纯蛋白质蛋白质在水溶液中的溶解取决于蛋白质分子表面离子

13、周围的 水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜 的程以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。 蛋白质溶液中加入中 性盐后，由于中性盐与水分子的亲和大于蛋白质， 致使蛋白质分子 周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离 子强发生改变， 蛋白质表面的电荷大被中和， 加导致蛋白质溶 解低， 使蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在同盐 浓中的溶解同， 同饱和的盐溶液沉淀的蛋白质同， 从而 使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将酸铵、 化钠或氯化 钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏， 导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。盐析法简单方， 可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、 蛋白质的浓缩等。但盐析法提纯的抗原浓高， 只能用于抗原的初 步纯化。目前盐析法应用于免疫球蛋白和酶提取、分离纯化、浓缩等 和中药的提取。