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1、内蒙古民族大学本科生毕业论文前 言禽流感是由A型流感病毒引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽的传染病，同时也是一种人畜共患病、我国将其列为一类动物传染病1。早在1878年，该病就在意大利的流行，当时叫“鸡瘟”。1981年在美国马里兰州召开的第一届国际禽流感学术讨论会上废除了“鸡瘟”这一病名，改称高致病性禽流行性感冒。由基于该病在经济上的重要性，尤其是考虑到该病感染人的巨大威胁，对该病毒的基础研究显得迫在眉睫。目前，与其他病毒性疾病相同，禽流感的防制尚无特别有效的方法，接种疫苗是预防禽流感发生与传播的最有效手段。随着禽流感病毒多种亚型的发现，以及基础免疫学理论、分子生物学及生物技术的发展，科研人员已
2、研发出了针对禽流感的数种疫苗。除了应用较为普遍的全病毒灭活疫苗外，对多种新型疫苗的研发也有了较大的进展。 本文对目前国内外几种主要禽流感疫苗进行简要综述。1 病原禽流感病毒(AIV)属于正黏病毒科, 流感病毒属。一般多形性,直径为80-120纳米,也可见有同样直径的丝状形态,长短不一。禽流感病毒是分节段的单股负链RNA病毒,共有8个独立的RNA片段,每个RNA片段都以不同的核酸蛋白复合体形式存在。这8个片段编码10种蛋白,其中有8种结构蛋白, 2种非结构蛋白。病毒表面有10-12纳米的密集钉状物或纤突覆盖,病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。两种不同形状的表面钉状物是HA(棒状三聚体)和NA(蘑菇形四聚
3、体)。禽流感病毒粒子大约由0.8%-1.1%的RNA,70%-75%的蛋白质,20%-24%的脂质和5%-8%的碳水化合物组成。病毒蛋白包括HA蛋白、NA蛋白NP蛋白、非结构蛋白、M蛋白、聚合酶蛋白。2 禽流感病毒的分类及致病性2.1 禽流感病毒的分类禽流感病毒（AIV）可按病毒粒子表面的血凝素和神经氨酸酶的糖蛋白进行分类,分为15个H亚型和9个N亚型,其血清型有H1N1、H4N2、H5N1、H5N2、H7N2、H9N2 等。其中最受关注的是含H5和H7血凝素的AIV。这些病毒常表现出具有或转变为高致病性的潜力(短期内变异),出现这种变异的原因是最初的病毒未受到强有力的控制而得以在许多鸡群中繁
4、殖和传播。有时很难将实验室分类的结果与病毒可能在某一鸡群中引起的病情关联起来, 即无致病性AIV在有些情况下也可能表现明显的致病性。2.2 禽流感的致病性禽流感病毒可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。其中高致病性禽流感是由H5和H7亚毒株（以H5N1和H7N7为代表）引起的疾病。高致病性禽流感特点是潜伏期短，传播快，发病急，发病率高，死亡率高，但传播范围往往不大。低致病性禽流感特点是潜伏期长，传播慢，病程长，发病率和死亡率低，一旦发病，如不采取积极措施，病毒很难在疫区根除，疫情会逐渐向周边地区扩散，使疫区越来越大，而且病毒毒力还有变强的可能，应高度重视。2.3 禽流感的人致病性在1997
5、年香港首次发现禽流感病毒能感染人并致人死亡的事件之前,研究者虽然提出了禽流感流行的动物源性学说,即病毒在动物内形成重组后再感染人。一般认为,决定流感病毒宿主特异性的主要因素是细胞膜上的受体和HA受体的结合位点的结构。人类与禽类细胞膜上的结合位点有很大的不同,这就是为什么1株流感病毒不能同时感染人和禽的原因。常见的流感病毒受体可因其对人和禽的结合不同分为两种。但从香港分离到的 HA 受体具有两种受体结合特异性,因此易于感染人类细胞。最新的研究已经表明,人和禽的流感病毒均可感染猪。而且,禽流感病毒经过猪体中的基因重组或重排过程,可以产生能感染人的新型流感病毒毒株。3 AIV理化性质AIV对热敏感,
6、加热到5830min,或加热到6110min,或煮沸(100)2min以上即可灭活,但病毒对低温抵抗力较强,在有甘油保护的情况下可保持活力1年以上;AIV在微生物环境中可存活1周,在水中可存活1个月,在pH=4.1时，也具有一定的存活能力。对紫外线敏感,在阳光下40-48h就会使AIV丧失活性,如果用紫外线直接照射,可迅速破坏其传染性。对消毒剂乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。常用消毒剂容易将其灭活,如氧化剂、稀酸、十二烷基硫酸钠、卤素化合物( 如漂白粉、碘剂等)都能迅速破坏其传染能力。4 禽流感的疫苗防控研究4.1 防控研究流感的防控主要从疫苗防疫、药物预防、饲养管理等方面综合进行防治。流感病
7、毒水平传播效率极高, 其致病力变异极为复杂, 并且对其机制迄今知之甚少, 故禽流感的弱毒疫苗自然成为可望而不可及的奢望。传统的灭活疫苗具有良好的免疫保护性, 是禽流感防制的主动措施、关键环节和最后防线, 在许多国家禽流感防制中都起到了极其重要的作用。禽流感灭活苗的使用, 在控制疫情的同时, 也一定程度上增加了疫病监测中区分疫苗免疫与自然感染的难度,全面的综合防疫措施与基因工程疫苗相结合才是我国禽流感防制的发展方向。4.2 国外现状虽然国外在DNA疫苗、表达AIV血凝素蛋白的新城疫载体疫苗等新型禽流感疫苗研究方面取得了新进展，但是目前国外只有两种疫苗通过了审批并应用于防控实际，即全病毒油佐剂灭活
8、疫苗和重组鸡痘载体禽流感疫苗。重组鸡痘载体禽流感疫苗在美国通过了审批，在欧盟没有类似的产品，但这种疫苗在美国没有使用，却广泛在墨西哥、危地马拉、萨尔瓦多等国家使用。从全球范围来看，大多数禽流感免疫预防是用禽流感油佐剂灭活疫苗。4.3 我国现状我国科研机构针对现行主要流行毒株亚型，研制了多种油乳剂灭活疫苗1和新型疫苗，取得了良好的免疫保护效果，受到联合国粮农组织、世界动物卫生组织等国际组织的关注。目前，农业部批准生产的H5亚型禽流感疫苗就有重组禽流感灭活疫苗(H5N1亚型，Re-1株)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)、禽流感灭活疫苗(H5亚型，N28株)、禽流感H5-H9二价灭活疫苗、
9、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rL-H5株)等5种。尽管新型疫苗展现了诱人的前景，但是与国外情形类似，目前我国仍主要使用灭活疫苗。5 疫苗的应用及种类 由于了解流感病毒的持续遗传变异是解决流感问题的关键，所以不断地评价病毒的抗原转变对于及时捕捉到可引起人类流感大流行的毒株，并且研制有效疫苗是非常重要的。理想化的疫苗应具备以下特点：（1）价格低廉、容易接种，对家禽具有高度的安全性；（2）任何家禽接种都有效，免疫后既能产生体液免疫应答，又能产生细胞免疫应答，并能迅速建立免疫性保护；（3）疫苗生产时对工作人员和环境安全；（4）休药期短或无休药期； 但目前，还没有任何一种禽流感疫苗同时具备上述全部特性
10、2。因此，逐步完善疫苗的研究显得尤为重要，现阶段常见的禽流感疫苗有以下几类：5.1 全病毒灭活疫苗 禽流感全病毒灭活疫苗是将疫苗株病毒接种于鸡胚尿囊腔中进行增殖，经梯度离心浓缩纯化后，用甲醛或者-丙内酯灭活处理制得。Takada 等对5周龄雌性ddY小鼠鼻腔接种用甲醛灭活的流感全病毒疫苗20L，23 周后再免，最后1次免疫后1周，分别检测血清和鼻拭子样品，并同时经鼻腔攻击20倍小鼠半数致死量的病毒，结果表明，该疫苗既可产生中和抗体，又能刺激机体CTL 反应，并能抵御不同亚型流感病毒的攻击。李明义等3-4用禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/77420/96（LPAI- H5N2）株及
11、A/Chicken/ Shanghai/1/98（H9N2）株分别接种易感鸡胚，收获感染胚液并超滤浓缩，再用甲醛灭活并加油佐剂混合乳化制成油乳剂灭活疫苗，将其接种4周龄SPF鸡，结果表明，疫苗安全。禽流感全病毒灭活疫苗具有制备工艺简单、免疫效果及安全性好、免疫持续时间长且不会出现毒力返强和变异的优点，可保护同种亚型AIV的攻击，有效避免禽流感的大暴发或大流行。但灭活苗本身存在一些缺陷，即影响疫情监测，存在散播病毒的风险，免疫剂量较大，制备成本高等。其最突出的缺点是不能诱导产生有效的黏膜免疫抗体和细胞免疫应答，因而，无法有效地抑制呼吸道中 AIV的复制5。5.2 亚单位疫苗 亚单位疫苗是提取AI
12、V具有免疫原性的抗原蛋白，加入佐剂而制成的。这种疫苗安全性好，能刺激机体产生足够的免疫力，但其抗体持续时间短，且成本高。随着重组 DNA及分子克隆技术的发展，可以将HA基因连接到载体质粒上，然后导入表达系统中，经诱导可获得大量表达的免疫原性蛋白，提取所表达的特定多肽，加入佐剂即可制成基因工程亚单位疫苗，这样可大大降低成本。刘明6构建了杆状病毒转移载体，分别表达了H5N1亚型禽流感病毒的HA基因和 NA 基因，用这些表达产物免疫SPF鸡，结果显示，NAHA 联合免疫组的免疫效果最佳。Wu 等7用酵母表达禽流感A/Northern shorel-er/AL/26/2006（H10N7）株的HA蛋白
13、，然后用该蛋白免疫SPF鸡，可以产生与灭活苗相同效果的HI抗体及中和抗体。5.3 重组活载体疫苗 利用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作载体，构建含有免疫原性基因的重组病毒，用此重组病毒作疫苗，可在动物体内复制，并不断地表达出免疫原性蛋白，从而诱导禽类产生针对目标病原的免疫保护力，此种疫苗称为重组活载体疫苗。Boyle等8构建了表达H7亚型HA基因的重组痘病毒，接种2-7日龄鸡，分别于接种后第10，21天，用强毒株攻击，致死保护率分别为80%和100%。获得保护鸡有NP抗体反应，表明重组痘病毒疫苗虽可提供坚强保护，但不能完全阻止攻毒AIV的复制。Swayne 等9研究表明，禽流感重组痘病毒
14、疫苗应避免用于经痘病毒疫苗免疫的鸡群或自然感染野毒痘病毒鸡群，否则，将不能诱导其对禽流感的良好免疫应答。Li等10将高致病性的 H7N1 血凝素基因插入到 HVT，构建了重组病毒，免疫动物产生特异性抗HVT和AIV HA 抗体，对HVT 和AIV强毒的攻击均能提供良好的保护。Qiao等11构建了能同时表达H5N1亚型HA基因和NA基因的重组禽痘病毒（fowl pox virus，FPV）重组疫苗，攻毒结果显示，该疫苗具有良好的免疫保护性。高宏博等12将AIV A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）的HA基因克隆于真核表达质粒中，构建了转移载体pUAB- gpt- HA，通过同
15、源重组及霉酚酸筛选技术，将HA基因表达盒插入到HVT US10 基因区，构建了一株表达H5亚型AIV HA 基因的重组病毒 HVT（rHVT- US10- HA），经PCR、间接免疫荧光、western blot 及红细胞凝集试验鉴定，重组病毒能稳定表达具有生物学活性的HA蛋白。重组活载体疫苗兼具死疫苗和活疫苗的优点，克服了常规活疫苗毒力返强的缺点，且免疫效果较理想。但重组载体系统本身特性以及在对插入的外源基因的选择等方面仍存在很多问题，仍需进一步研究。5.4 核酸疫苗 核酸疫苗又称为DNA疫苗，是伴随现代分子生物学和免疫学的发展而产生的一种新型疫苗。其原理是利用重组DNA技术将保护性抗原蛋白
16、的基因克隆到真核表达载体上，在被直接导入到动物体内后，保护性抗原蛋白基因表达的抗原蛋白经过内源性呈递给免疫系统，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。何宏轩等13-14将不同亚型AIV的HA基因构建了真核表达质粒，并用构建好的质粒对试验鸡进行免疫，进行攻毒后，将免疫组和对照组的试验结果进行比较，结果表明，所构建的HA基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。张丹等15设计并构建了包含禽流感H5HA和H7HA1基因的双价真核表达质粒pV- H5- H7及单独表达 H5HA和H7HA1的 pV- H5 和 pV- H7HA1，通过RT- PCR，间接免疫荧光（IFA）等方法验证构建质粒的正确性和其表达蛋白的免疫原性；0，21
