菌种传代和保育

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1、菌种传代和保育1 目的规范试验用菌种的管理制度，保证菌种正常保存和传代。2 范围适用于广州中大医疗器械有限公司质管部使用的菌种。3 责任质检部主管、经理、质检员。4 相关文件或表单菌种使用记录菌种卡片菌种检查记录菌种确认试验记录5 定义工作菌种：应用于日常实验中的菌种，如培养基灵敏度检查、验证实验等。 传代菌种：只用于菌种的接种和传代、保存的菌种。6 菌种的管理6.1 菌种的购买和接收可选购买方：广东省微生物菌种保藏中心、广东环凯微生物科技有限公司。购买的原始菌种管 就是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料，包括菌种名称、编号等。 接收菌种时应检查安瓿的完整性。在相应的

2、菌种接收记录上记上关于菌种的所有信息，如名称、数 量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，标明菌种名称、编号、代次、接收日期、接收 人、贮存条件、效期。6.2 菌种的编号将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复温并转至新培养 基内生长，即认为已传代一次。从菌种保藏中心获得的冻干菌菌种为第 0 代，冻干菌菌种开启转种 后为第1 代。每次接种传代，每支保存菌种需标明菌名、统一编号、传代次数、接种日期、有效期 购进菌种若购进时有编号，延用原编号，于原编号前加菌种名称前两位汉字；若无，用购进日期代 替（例：2012年4月 9日购进无编号的大肠杆菌菌种，自编号为:大肠1

3、20409） 。传代编号包括原菌种号传代支数顺序号，每传一代，在原先的菌种编号增加一个传代号，菌 种分为传代菌种和工作菌种。每次接种传代一般6 支，传代菌种1 支，为编号 1；工作菌种5 支， 如用量较大的菌种，可适量增加其传代的数量。6.3 菌种选用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B)26003大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B)44102白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F)98001黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F)98003铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerug

4、inosa) CMCC(B)10104生抱梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B)649416.4 菌种保藏方法保藏方法大致可分为以下几种：6.4.1 传代培养保藏法有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等(后者作保藏厌氧细菌用)，培养后于46C冰箱内保 存。6.4.2 液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的 液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代 谢作用。6.4.3 载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法

5、，例如沙土 保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。6.4.4 冷冻保藏法可分低温冰箱(-20-30C, -50-80C)、干冰酒精快速冻结(约-70C )和液氮(-196C )等保 藏法。6.4.5 冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度(-70C左右)下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥)。备注：有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液， 以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲 和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。根据保藏方法的易操作性和经济成本，下面重点介绍斜面培

6、养保藏发和液体石蜡覆盖保藏法6.4.6菌种保藏分四个阶段：挑选特征典型的纯菌菌落；确定保藏的合适菌体形态，抱子和芽 胞代谢作用较弱，同时对恶劣环境有很强的抵抗力，因此对凡是能产生抱子或芽胞的微生物都用抱 子和芽胞进行保藏；选择最适宜的保藏法进行保藏；定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生 变化，若有变化，需改变保藏方法，保藏期满应及时进行移种。6.5 真空冷冻干燥菌种的恢复培养 安瓿瓶开封：用浸过75酒精的脱脂棉擦净安瓿瓶，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已破裂的安瓿瓶顶端。用无菌吸管吸取0.3 0.5ml适宜的液体培 养基，滴入安瓿瓶内，轻轻振荡，使冻干菌体溶

7、解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，接种于 12 支建议的斜面培养基上，并在建议的温度下培养。菌种活化前，请将安咅瓦瓶保存在6 10C的环境 下。6.6 菌种的确认试验在菌种购买后传第一代前进行菌种的确认，包括目测菌落生长情况、染色镜检和生化试验,其中， 生物试验可选取12个项目进行试验。假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染 或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为 下一代。见附表A：试验用菌种的确认试验。6.7 菌种的保藏采用琼脂斜面低温保藏法，将经常使用的菌种的典型菌落接种在新鲜的琼脂斜面（生孢梭菌用庖 肉培养基）上，按细菌：温度3

8、5C、时间1824小时，真菌：温度25C、时间48 72小时，待充 分生长后，把培养好的新鲜菌种管用硅胶塞密封好，再用牛皮纸包好，放在46C左右的冰箱内保 藏。本法适用于经常使用的细菌、酵母菌、放线菌和霉菌保藏。为了延长保藏时间，试验用细菌可 采用菌悬液冷冻保存法。取生长健壮的第3代新鲜斜面菌种，加入23ml营养肉汤培养基，轻轻将 菌苔洗下，制成菌悬液或营养肉汤培养菌液，分装至几支灭菌小管。保存温度：-20C以下冷冻保 存。冷冻保存菌融化后，转种一次，即可使用，其余的菌液废弃。见附表B试验用菌种的保藏条 件与时限。采用液体石蜡保藏法，将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.

9、05kg/cm2， 121. 3C灭菌30分钟，然后放在40C温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将需要保藏的菌种，在最适 宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好 菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下 保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细 菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏12年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方 法很难保藏的脑膜炎球菌，在37C温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特 殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必

10、须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体 石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特 别注意。6.8 每周检查一次保存菌种的冰箱温度，并作记录，每周检查菌种管的硅胶塞是否松动，菌种外观 及干燥状态，如有异常应及时处理，并填写菌种检查记录。6.9 每次移植培养后，要与原种的编号、名称逐一核对，确认培养特征和温度无误后，再继续保存。 7.0 菌种的传代、接种和使用7.1 每株菌种应建立菌种使用及传代记录，斜面菌种应根据其特性决定传代时间间隔。7.2 传代时使用须核对名称、编号，传代代数及日期，所用培养基。7.3 传代和接种步骤7.3.1 先点燃酒

11、精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。7.3.2 再将原有的菌种斜面培养基（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管），持在 左手拇指、食指及中指之间，要注意能清楚地观察到斜面，菌种管在前，接种管在后，应斜持试管 呈 45角，使试管内斜面向上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表 面。7.3.3 首先，以右手在火焰旁转动两管的硅胶塞，以便接种时易于拔取。再以右手持接种环的柄端， 垂直或稍斜地把接种环在火焰上烧灼。顶端的环必须烧红，以彻底灭菌。环以上凡接种时可进入试 管的部分，也应通过火焰烧灼。烧灼时，应把环置于酒精灯的外焰上，因外焰的浓度比内焰高，容 易烧红。

12、7.3.4 使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔出两支试管的硅胶塞， 持住，再将试管口在火焰上通过，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。7.3.5 先将烧灼过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基土，如有熔印则表明接种环 未冷却能烫死细菌。一定待冷后，再从斜面上挑取菌苔少许，取出时接种环不能通过火焰，应从火 焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。划线时，一般先由下而上划一直线后，再由下而上 划曲线。操作过程应迅速，勿使菌苔粘至管壁或管口。7.3.6 当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上硅胶塞，不要将管口离开火焰旁 去迎接右手的硅胶塞。最后将接

13、种环烧灼灭菌放置原处，再把可能未塞紧的硅胶塞塞紧，即可进行7.3.7 传代和接种使用后，应填写菌种卡片及使用记录。7.4 控制传代次数，传代次数越多，突变的几率越大，因此要尽量少传代；根据菌种特性和实际保 存情况，一般最多传代不超过5 代，超过此次数应灭活处理，并于菌种检查记录上进行记录。7.5 做完试验的菌液以及测量完抑菌圈后的培养皿，阳性菌对照废弃物，要灭活处理。7.6 菌种有异常情况或有杂菌生长，则应随时更代，并可在传代中，选择典型菌种作传代菌种。附表A：试验用菌种的确认试验菌种名称”试验项目目测镜检生化试验（可选做）大肠埃希菌营养琼脂斜面上菌苔通 常白色，有时带黄白色， 湿润，闪光，蔓

14、延生长为成对和呈短链排列的 近球形的杆菌一般不形成荚膜革兰氏染色为阴性明胶穿刺：不液化明胶 靛基质试验：阳性 甲基红试验：阳性V.P.试验：阴性 柠檬酸盐利用试验：阴性金黄色匍萄球菌营养琼脂斜面上菌苔生 长茂盛，半透明，光滑， 平坦，湿润，白色至浅 黄色或橙色为单个或成对呈短链和 不规则堆团状排列的球 菌，革兰氏染色为阳性明胶穿刺：呈囊状液化硝酸盐还原：阳性过氧化氢酶试验：阳性铜绿假单胞菌营养琼脂斜面上菌苔生 长旺盛，薄，白色，闪 光，培养基变为绿色至 暗褐色或黑色，发荧光为单个，成对或呈短链 排列的杆菌，有运动性 革兰氏染色为阴性明胶穿刺：迅速液化明 胶，液体呈浅黄绿色或浅 蓝绿色吲哚试验：

15、阴性硝酸盐还原试验：阳性生抱梭菌/菌体粗大单独存在或呈 短链排列，芽抱比菌体 宽，芽抱呈梭形， 革兰氏染色为阳性过氧化氢酶试验阳性白色念珠菌改良马丁琼脂斜面上菌 苔生长茂盛，光滑，湿 润，菌落呈乳白色可见卵形细胞，有多边 芽殖现象，有假菌丝/黑曲霉可见分隔菌丝体，分生抱子穗球形，黑色可见分隔菌丝体，分生抱子穗球形，黑色/附表B试验用菌种的保藏条件与时限菌种丄卄氓甘 培养基培养温度传种时间大肠埃希菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液4 6C20 C1个月3个月2年大肠埃希菌不得多次冷冻传代，否则菌落形态会出现变异，边缘不整齐。金黄色匍萄球菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液4 6C20C1个月3个月2年铜绿假单胞菌营养琼脂斜面液体石蜡覆盖保存法室温3个月9个月2年铜绿假单胞菌保存时，色素会随着放置时间的延长发生亮绿一深绿一墨绿一棕色的变化。无色素时 需接种至营养丰富的培养基中划线营养琼脂平板，挑取典型菌落，转种，色素得以恢复。生抱梭菌疱肉培养基液体石蜡覆盖保存法4 6C4 6C6个月2年白色念珠菌4 6C3个月9个月改良