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1、生物样品预处理预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作 均在4C下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl溶液洗去血丝，用滤纸吸十后称重。将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆(匀浆比(W/V) 1:5)，腮组织放入组织匀浆(匀浆缓冲液含 40mmol/L 咪唑，250mmol/L 蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0)，匀浆比为 1:40，匀 浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4C下离心(9000g，
2、20min)， 取上清液-80C下保存，待测。(1) 250mL 0.15 mol/L KCl：取 2.7956g(2) Tris-HCl 缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris( 1.5143g)+ 105mL 0.1 mol/L HCl+KCl (0.15*0.23*74.55=2.5720g)(Na+K+)ATPase活性的测定1、试剂(1) 匀浆液(250ml)： 40mmol/L 咪唑 0.6808g+250mmol/L 蔗糖 21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g(2) 反应缓冲液(250ml)： 80mmol/L 咪唑 1.3616g+4mmol/L
3、MgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g(3) 16mmol/L Na2ATP (10ml)： 0.0988g(4) 30%三氯乙酸(TCA) 9g TCA+21mlH2O(5) 定磷试剂(硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml)： 10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O每 10ml 加入 FeS04 0.5g (FeS04 - 7H2O 0.0941g)，25ml 加入 FeSO4 - 7H2 O 0.2353g，临用前配制。5mol/LH2SO4： 2.7ml H2SO4+7.3mlH2O(6) 1mmol/L 乌本苷(100ml)：
4、0.0767g(7) 50Pg/mL 磷标准溶液(1000ml)： 0.2195gKH2PO42、 无机磷标准曲线的绘制：各试管分别加磷标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00m1 及蒸馏水 1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0 m1，混匀后各吸取 0.08ml加入酶标板，同时加入0.08mlTCA，0.08ml定磷试剂，混匀后650nm处比 色测吸光值。3、酶活性测定ATPase制剂：匀浆比(W/V)为1:40，离心10min (9000r/min)取上清液 得到。总酶活：酶液101+反应缓冲液40pl+H2O 201+ Na2ATP 101 (空白用H
5、2O代替Na2ATP,空白仍需加入酶液)。25C保温15min后加入冷的30%TCA80 卜1终止反应+定磷试剂801，静置5min后读数。Mg2+-ATP酶活：酶液101+反应缓冲液40pl+H2O 101+乌本苷101+ Na2 ATP 101，其余同总酶活性测定。4、蛋白质含量测定1:40匀浆后1:5稀释测蛋白。5、计算10Rl蛋白质含量：X*5*10 pgPi浓度计算：有标准曲线得Ypg/mlm= X*0.08 ml n=m/M=m*103/31 nmol10pl酶液的量：Pi的物质的量：ATP 活性：n*4/蛋白质含量=X*0.08*103*4/31 pmol/mg pro/hSOD
6、酶活性测定1、试剂一(1) Tris-HCl 缓冲液0.1mol/l的盐酸：取浓盐酸(密度为1.18，36%) 8.4ml，加双蒸水稀释至1000ml o0.1mol/l 的Tris 溶液：取6.057 克Tris，加水溶解，配成500ml o Tris-HCl 缓 冲液(pH 为8.4,浓度0.1mol/l)：取86ml 0.1mol/l 盐酸，取250ml 0.1mol/l 的Tris 溶液，加双蒸水稀释至500ml。(2) 10mmol/l HCl:取0.1mol/l 的盐酸 10ml，加双蒸水稀释至 100ml。(3) 6mmol/l 邻苯三酚(精确)：用 10mmol/l HCl 配
7、制。0.07567 g+100ml10mmol/l HCl。2、邻苯三酚自氧化速率的测定邻苯三酚自氧化速率的测定：在酶标板孔中加入300应Tris-HCl缓冲液，放置 酶标仪中25C恒温10min，加入预热的邻苯三酚及10日L双蒸水，在420nm处每30s 测定一次吸光值，自氧化速率在3分钟内有效。调整邻苯三酚用量，使线性范围 内吸光度值的变化速率控制在0.020OD/分。(注：实验时要确定邻苯三酚的用量， 可先做8、9、10应各两个)3、酶活性测定SOD活性测定与步骤2相同，只是将双蒸水换成同体积酶液。在420nm下， 每隔30秒钟测吸光度值一次，计算平均每分钟的吸光度变化值 A420/分。
8、控 制SOD样品液的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定体系后，使邻苯三酚自氧 化速率的吸光度值逐渐下降，即联苯三酚自氧化速率被抑制50%左右。注：取组 织匀浆时，可先做1、3、5倍稀释管各两只，以确定稀释倍数。(参考：将1:9 匀浆液再稀释20倍用以测定鱼肝酶活。(3)计算)样品液中SOD活力单位定义：在规定条件下，1ml反应液中，每分钟抑制联苯三酚 420nm下自氧化速率达50%时的酶活力单位(U)或称Marklund单位。 每mg蛋白的总SOD活性单位数称为样品液的SOD比活。样)X样SOD活力(U/ml)= (0.020-A420)/0.020X 100% /50% X V / (V- V
9、品稀释倍数总 定义：反应总体积3 (ml)总、：加入样品液的体积3 (ml)样:酶活力单位定义体积1 (ml)定义GST酶活性测定1、试剂(1) 0.1mmol/L磷酸缓冲液母液：0.2mol/LNa HPO (取Na HPO 7H O 53.65g； Na HPO 2H O 35.61g； N24242242a HPO. 12H O 71.64g加蒸馏水定容至 1000mL)。0.2mol/LNaH PO.(取Na HP乙IZ-iZ-iIZ-iO4 - H2O 27.6g； Na2HPO42H2O 31.21g加蒸馏水定容至1000mL)(母液浓度为0. 2mol/L，配时注意浓度稀释倍数)
10、PHA(mL)B(mL)6.531.568.57.061.039.07.481.019.08.094.75.30.1mol/LNa2HPO4 - 12H2O 500mL:取 17.907g；0.1mol/LNaH2PO4 - 2H2O 1000mL:取 15.601g；(2) 1.0mmol/LCDNB100m:取0.0202g (巨毒，先用无水乙醇溶解，再加水)(3) 1.0mmol/LGSH (现配)10mL:取 0.0031g(4) 反应体系：100pL0.1mmol/L 磷酸缓冲液+10pL1.0mmol/LCDNB+10pL1.0m mol/LGSH+880pL 双蒸水(共 1mL)
11、2、活性测定10pL酶液+170pL反应体系，340nm读数，20s间隔一次，读3分钟。GST 活性定义为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶促反应，使GSH浓度降低1nmol/L 为一个酶活力单位(nmol/mg protein/min )。3、计算R=180pL，8 =9.6mmol-1cm-1，P=0.54cmGST 活性=(OD*R*106)/(萨W)EROD酶活性测定1、试剂_(1) 0.1mol/L pH8.0Tris缓冲液 100mL： 50mLTris (0.1mol/L) +29.2mLHCl (0.1mol/L)PH0.1mol/LTris(mL)0.1mol/LHCl(mL)7.
12、15045.77.45042.08.05029.20.1mol/LTris100 mL： 1.2114g(2) 2. 5 mmol/L NADPH 1mL： 0.0021g (药品较贵，且每次配量少，不易取， 所以应配在锥形容量瓶中，配药时不用称量勺，拿着小瓶直接往称量纸上倒)(3) 40pmol/L 乙氧基试卤灵 100mL： 0.001g2、 活性测定_10pL酶液+140pL缓冲液+40pL NADPH+10pL乙氧基试卤灵，空白不加 NADPH，25 C 保温 30min, 572nm 读数。3、计算蛋白质浓度：x=(y-0.0269)/0.806 mg/ml8 =73mmol-1cm
13、-1EROD 活性=(OD*230*106)/(73*10*W*0.685*30) (W 为蛋白质含量)GSH含量的测定1、试剂(1) 10%TCA： 1g +10ml H2O(2) 0.4mol/L pH8.9Tris缓冲液 100mL： 50mLTris (0.4mol/L) +7mLHCl (0.4mol/L)(3) 2.5mM DTNB： 0.004g DTNB +2 mL缓冲液(现配，时间长了会变色)(4) 25,M GSH 储备液：；2、 活性测定_10pL 酶液+10pLTCA+ 200pL Tris 缓冲液(0.4M pH 8.9)混匀，25C 或室温 孵育5分钟+20pL 2
14、.5mM DTNB，反应总体积240pL，混匀后25分钟，415nm 测吸光值。3、标准曲线绘制：各试管分别加25pM GSH储备液(零下4C可放置1个月)0、0.20、0.40、 0.60、0.80、1.00m 1 及蒸馏水 1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0 m1，混匀后各 吸取10pl加入酶标板，10pLTCA，同时加入200pLTrisS冲液，25C或室温孵育5 分钟后加入20J1LDTNB，混匀后25分钟，415nm测吸光值。4、计算CAT活性测定1、试剂匀浆后用生理盐水稀释10倍，制得粗酶液。(1) pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液：(2) 基质液：65
15、四mol/mL HO，以pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液稀释100 mL： 24.3ml 0.2mol/L Na；HPO4 (100 mL用 1.7406g) +5.7ml 0.2mol/L NaH2PO4 (100 mL用0.1778g) +6701 30% HO，稀释至 100 mL。30% HO (W/V)：密度 1.11g/cm3。2 2(2)钼酸铉：32.4mmol/L (用四水合钼酸铉 1235.86，4.0042g/100mL)2、活性测定试剂测定管标准管1对照管标准管2缓冲液-0.1-0.6基质液0.50.50.5-粗酶液0.1-0.1-钼酸铵 0.50.50.50.5加入基质液后置于37 水浴5min，加入酶液后将所加过试剂的试管在37C水 浴1min (对照管不加热)，然后立即加入钼酸铵5001,混匀10 min后在405nm处 以去离子水调零比色(汲取200四1加入酶标板)。试剂液不够可根据比例适当增加 1倍。
