细胞转染的步骤

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1、转染B添加义项2 .DNA小片段插入体细胞或细胞系的过程。若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称 “瞬时转染(transient transfection)”：若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制称稳定 转染(stable transfection)”。10本词条正文缺少必要目录或最新动态,欢迎务位编辑词条，额外获取10个积分。基本信息中文名称转染外文名称.transfection过程.真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。瞬时转染transient transfection稳定转染stable transfection目录展开基本简介标志的过程。转染(transfe

2、ction)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染(永久转染)o前者外源 DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表这，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果，常常用 到一些报告系统如荧光蛋白，B半乳糖昔酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比 超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合

3、到染色体中概率很小，大约1/104转染 细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶(APH：新霉素抗性基因)， 潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸昔激酶(TK)等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细 胞数量，培养及检测时间等。相关分类化学转染法包括：1.DEAE-葡聚糖法，2.磷酸钙法，3.人工脂质体法。DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动 物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功地应用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分

4、可靠。磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取 得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和氯化钙混合，然后加 入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通 过细胞胞膜的内吞作用摄入DNAo磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而 保护外源DNA免受降解.人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以 转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核甘酸到人工酵母染色体不同长度 的DNA,以及RNA,和蛋白质.此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与 以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和

5、人的体内用于基因治疗。人工合 成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内，至于DNA是如何穿过核膜的, 其机理目前还不十分清楚.物理方法包括：显微注射电穿孔基因枪等，显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细 胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研 究。电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲 电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系，基 因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方

6、法适用于培养的细胞核在体的 细胞.相关实验实验目的学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法一脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观,测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。实验原理外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击 法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入：磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体 物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了 外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞邪旦是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控 制较严、难度较大：病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影

7、响；所以现在对 于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染 的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染 条件对于效率的提高有巨大的作用。本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体 和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。实验材料（1）材料293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素（双抗）、 FCS （小牛血清）、PBS （磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/ED

8、TA消化液、转染试剂（TransFast）（2）器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴 箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD实验步骤细胞传代（1）试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试 管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。(2)弃掉培养皿中的培养基，用1 ml的PBS溶液洗涤两次。一转染用Tip头加入ImlTrypsin液，消化1分钟(37。C, 5%CO2)用手轻拍培养瓶壁，观 察到细胞完全从壁上脱落下来为止。(4) 加入

9、1 ml的含血清培养基终止反应。(5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。(6) 将培养液装入离心管中，WOOrpm离心5min。(7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。(8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。(9) 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。细胞转染1) 转染试剂的准备A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。B. 震荡后将试剂放在一20摄氏度保存，使用前还需震荡，。2) 选择合适的混合比例(1： 1-1： 2/脂质体体枳：DNA质量)来转染细胞。在一个转染 管

10、中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA.震荡后在 加入合适体积的转染试剂，再次震荡。5) 将混合液在室温放置10-15分钟。6) 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。7) 加入混合液，将细胞放回培并箱中培养一个小时。8) 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小 时。第二次细胞传代1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培奔皿将细胞重 新粉入培养皿中。3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

11、研究进展转染技术国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效傍0率高受到研究者们的青眯。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子， 使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(potonsponge)体。这种聚阳离子 能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染

12、性能好于树枝状聚合物，而旦它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治 疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。转染效率线型PEI (LinePEl.LPEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(BranchedPEl.BPEI)要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复 合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研 究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性 也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现 这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键 的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其 具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒， 从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件卜可降解的化学键 在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEL这样结构的转染试剂在体外 应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。