两点法终点法速率法

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1、什么叫两点法、终点法、速率法？两点法:测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度得总变化量以求 取酶反应初速度得方法。终点法:通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量,以求出 酶活力得方法，亦称平衡法。速率法:就是指连续测定（每1 5秒1分钟监测一次）酶反应过程中某一反应产物 或底物得浓度随时间得变化来求出酶反应得初速度得方法，即连续监测法、一、常用生化检测项目分析方法举例1. 终点法检测常用得有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或 重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（漠甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、 葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）

2、、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三 酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷III法）、 磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等、以上项目中，除钙、磷与镁基本上还使用单试 剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点 终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用、2、固定时间法 苦味酸法测定肌酐采用此法。（两点法）3. 连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、 天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、Y谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶 与肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定得项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联 法测定尿素

3、等，也可用连续监测法、4、透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应得项目，多数属免疫比浊法, 载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗O”、类风湿因子，以及血清中得其她蛋白质 如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。二、分析参数设置分析仪得一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均 已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定项目得分析参数（an a ly s is par a m e te）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用;目前大多数生化分析仪为 开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目得空白通 道，由用户自己设定分析参数、因此必须理解各参数得

4、确切意义。一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数就是分析仪检测得前提条件，没有这些参数无法进行检测。1。试验名称 试验名称（test code）就是指测定项目得标示符，常以项目得英文 缩写来表示。2。方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等, 根据被检物质得检测方法原理选择其中一种反应类型。3。反应温度一般有3 0C、37C可供选择，通常固定为37C。4。主波长 主波长（p r im a r y wavel e ng t h）就是指定一个与被测物质反应产 物得光吸收有关得波长。5。次波长 次波长（sec 0 nda r y wave 1 ength）就是

5、在使用双波长时,要指定一个与 主波长、干扰物质光吸收有关得波长。6。反应方向 反应方向（re spo n se direct i on）有正向反应与负向反应两种，吸 光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。7. 样品量 样品量(samplin g v o l u m)一般就是2四l35四1 ,以0。川1步进,个别分 析仪最少能达到1、6四1。可设置常量、减量与增量、8. 第一试剂量 第一试剂量(fir st r egeng t v o l u m)一般就是2 0300四1,以1四1步进、9. 第二试剂量 第二试剂量(s e co n d rege n gt vo 1um)一般也就是2 03

6、00四1,以川1步进、10. 总反应容量 总反应容量(total r eact i ng v o lum)在不同得分析仪有一个不 同得规定范围，一般就是1 80350四1 ,个别仪器能减少至120四1、总反应容量太少 无法进行吸光度测定。11. 孵育时间 孵育时间(inc ubate time)在终点法就是样品与试剂混匀开始至反 应终点为止得时间,在两点法就是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择 点为止得时间。1 2 .延迟时间延迟时间(delay t ime)在连续监测法中样品与反应试剂(第二试剂) 混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间得时间。1 3.连续监测时间 连续监测时间(c

7、o n tinuous mon it ori n g t i m e )在延迟时 间之后即开始，一般为60120s，不少于4个吸光度检测点(3个吸光度变化值)。1 4 .校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点得，可采用一个校准液(c a 1i brat o r);线性好但不通过坐标零点,应使用两个校准液;对于校准曲线呈 非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适得浓度。15. 校准K值或理论K值 通过校准得到得K值为校准K值(c al ibrat e c oefficient)或由计算得出得K值为理论K值。16. 线性范围即方法得线性范围(linearity range

8、),超过此范围应增加样 品量或减少样品量重测、与试剂/样品比值有关。17. 小数点位数检测结果得小数点位数(decima 1poi nt digit)。(二) 备选分析参数这类分析参数与检测结果得准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也 能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确、1。样品预稀释设置样品量、稀释剂量与稀释后样品量三个数值,便可在分析前 自动对样品进行高倍稀释、2。底物耗尽值 底物耗尽值(sub s trate e xhaust limit)在负反应得酶活性测定中, 可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持 零级反应而导致

9、检测结果不准确。3. 前区检查免疫比浊法中应用，以判断就是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸 光度值得差别(AA)设置一个限值，如果后一点得吸光度比前一点低，表示已有抗原 过剩,应稀释样品后重测、4、试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。5。试剂空白速率 连续监测法中使用,就是试剂本身在监测过程中没有化学反应 时得变化速率、6. 方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果得一致性,有斜率与截距 两个参数。7、参考值范围对超过此范围得测定结果,仪器会打印出提示。（三）某些参数得特殊意义1. 最小样品量最小样品量就是指分析仪进样针能在规定得误差范围内吸取得 最小样品量。一

10、般分析仪得最小样品量就是21,目前也有小至1。6叫得。在样 品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度得情况下往往需采用分析仪得最小样品量 作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）得上限得以扩大。2. 最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低得检测项目,如血清白蛋白得漠甲 酚氯法测定，以往手工法操作时样品量1 0叫,试剂量4m 1 ,这样试剂量/样品量比 例（R/S）为2 00，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后,R/S却很难达到2 00,致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。3 .弹性速率在酶活性测定中,当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时, 有些仪器具有

11、弹性速率（flexrate）功能,能自动选择反应曲线上连续监测期 中仍呈线性得吸光度数据计算结果，使酶活性测定得线性范围得以扩大。如AST 可从10 O0U/L扩展至4 0 0 0U/L,从而减少稀释及重测次数、降低成本。4. 试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法 测定肌酐有负干扰、因为胆红素在肌酐检测得波长5 0 5nm有较高光吸收，而且胆 红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素得光吸收呈下降 趋势。若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率,因为此段中苦味酸尚 未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂得碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二 试剂

12、加入后得速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素得负干扰，见图 78、二、单波长与双波长方式（一）概念采用一个波长检测物质得光吸收强度得方式称为单波长（mono-waveleng th）方式。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分得吸收峰与其它 共存物质得吸收波长无重叠时，可以选用。在吸光度检测中,使用一个主波长与一 个次波长得称双波长方式。当反应液中存在干扰物得较大吸收、从而影响测定结 果得准确性时，采用双波长方式更好。（二）双波长得作用双波长（di-wa v elen gth）测定优点就是消除噪音干扰;减少杂散光影响;减 少样品本身光吸收得干扰。从光源，到比色杯、单色器、检

13、测器得整个光路系统 中,均存在着随时间发生变化得不稳定得检测信号,即噪音，而双波长检测就是同 时进行得，两种波长检测产生得噪音基本上相同,因而能消除噪音干扰。当样品中 存在非化学反应得干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性 得光吸收，而干扰测定结果得准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类十 扰,提高检测得准确性。（三）次波长得确定方法当被测物得主波长确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱 特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同得光吸收值，而被测物在 主、次波长处得光吸收值应有较大得差异。一般来说次波长应大于主波长100 n m、以主波长与次波长

14、吸光度差来计算结果。（四）双波长得具体应用对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法得分析项目,尤其就是单试剂分析 中，可以利用双波长得方式来部分消除样品本身得光吸收干扰。目前用单试剂法 测定得项目应用双波长得为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长5 76nm; 血清白蛋白（漠甲酚氯法）主、次波长分别为600与700nm;钙（偶氮砷III法）主、次 波长分别为660、7 7 0nm;磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺 蓝法）主、次波长为50 5与6 0 0 nmo三、单试剂与双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式,加两次试剂便为双试剂方式、目前得生 化分

15、析仪大多可用双试剂方式分析，其优点就是:可提高试剂得稳定性，多数双 试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短;能设置两点终点法，来消除来自 样品本身得光吸收干扰;在某些项目检测时能消除非特异性化学反应得干扰。 如血清ALT测定，血清中得内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中得指示酶（乳 酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。若先加入缺乏a一酮戊二酸得第一试剂，使其它酮 酸与指示酶反应之后再加入含有a-酮戊二酸得第二试剂，启动真正得ALT酶促反 应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶得反应消耗得NAD +能真正反映ALT得 活性，从而消除以上副反应得影响。四、测定过程得自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对

16、测定过程进行各种监测得功能，以便在没 有人”监督”化学反应得情况下提高检测得准确性。高档分析仪得监测功能更强。1. 试剂空白监测 每种试剂都有一定得空白吸光度范围，试剂空白吸光度得改变往 往提示着该试剂得变质:如利用Trinder反应为原理得检测试剂会因酚被氧化为 醍而变为红色;碱性磷酸酶、Y-谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出 硝基酚或硝基苯胺而变黄;有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度 升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放 置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。试剂空白得测定方法有两种:每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试 剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂得分析仪