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1、温和噬菌体诱导和噬菌斑观察、教学目标及基本要求:1. 了解温和噬菌体的性质，学习溶源菌的检查方法。2. 掌握噬菌体效价测定方法3. 了解噬菌斑的形成过程。二、实验原理温和噬菌体侵染宿主细胞后将其基因组整合到宿主细胞的染色体组中，使宿主细菌成 为溶源性细菌。溶源性细菌一般在生长繁殖过程中可自发的发生极低频率的裂解，释放出具 有感染力的噬菌体。可以用物理或化学的方法诱导，使其大部分或全部裂解。检测时需要有 对此温和噬菌体敏感的宿主细胞，即溶源性细菌释放的噬菌体对于该细胞而言是烈性噬菌 体，该细胞被称为敏感株。敏感株可以从待检的溶源株相近的种或变种中找到。实验中选用携带X/dX噬菌体的大肠杆菌，称为
2、双重溶源性菌株。该菌株同时滋完整 噬菌体和入缺陷噬菌体（dQ侵染。该菌株一般用于咼频转导，两种噬菌体中只有完整的X噬 菌体才能在侵染敏感株后于固体平板上形成噬菌斑。每毫升噬菌体裂解液中所含的噬菌体数 量被称为噬菌体效价，一般以每毫升噬菌体裂解液在含有敏感菌的固体平板上形成的噬菌斑 的数量来表示。裂解量则是表示一个细胞被裂解后所释放出的噬菌体数量，可以根据每毫升 裂解的溶源性菌株数量和效价进行计算。三、实验材料1. 菌种：带有噬菌体入和缺陷噬菌体（入dgal+）的双重溶源菌（E.coli Kl2F2gal-/入dgal+/入）敏感菌大肠杆菌（E.coli K12Sgal-）2. 培养基：肉汤固体
3、培养基，肉汤液体培养基，肉汤半固体培养基（0.6%琼脂），加倍肉 汤培养基（成分与肉汤培养基相同，但浓度加倍）（见附录II-1.1）。3. 含镁磷酸缓冲液：磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾0.7g,硫酸镁0.025g,蒸馏水1000ml。4. 生理盐水，氯仿。5. 其它：培养皿（7.5cm），磁棒，磁力搅拌器，紫外照射箱，无菌移管，水浴锅等。四、实验内容1. 噬菌体的诱导和裂解液的制备（1）菌体培养1）从供体菌E.coli K12F2gal-/入dgal+/入菌株斜面挑取1环接种于3ml肉汤培养基中,37C 振荡培养18h。2）取1ml培养液接种于装有9ml肉汤液的150ml三角瓶中，37C振荡培养
4、46h。（2）噬菌体的诱导和裂解液的制备1）取10ml培养液，离心（3500r/min, 15min）收集菌体。菌体用10ml加镁磷酸缓冲 液离心洗涤12次，最后将菌体悬浮于3.1ml加镁磷酸缓冲液中，制成细胞悬浮液。取0.1ml 菌悬液用生理盐水稀释，参照细菌菌落总数测定方法检测菌悬液中的溶源菌数量（NJ。2）将其余3ml菌悬浮液放入Q 75mm培养皿中，在诱变箱内以紫外线照射10s，然后加 入3ml加倍肉汤培养液，于37C避光培养23h。3）取0.1ml菌悬液用生理盐水稀释，参照细菌菌落总数测定方法检测菌裂解液中的残 存的溶源菌数量（N2）。另取5ml经诱导的处理液移入离心管中，加入0.4
5、ml氯仿剧烈震荡30s。 离心（3500r/min, 15min）分离，小心地将上清液移入另一支离心管中，此液即为噬菌体裂 解液。2噬菌体裂解液效价和裂解量的测定（1）敏感菌的培养1）从受菌体E.colK12Sgal-菌种斜面取1环菌,接种于3ml肉汤培养液中，37C培养18h。2）取1ml培养液接种于装有9ml肉汤培养液的150ml三角瓶中，37C培养46h （将剩 余的菌液留下，为下一个实验做点滴法观察高频转导现象用）。（2）效价的测定1）用肉汤培养液将噬菌体裂解液10倍递增稀释至10-9。2）取6支装有5ml肉汤半固体培养基的试管，溶化培养基并冷却至4550C（水浴保 温），分别加入0.2ml敏感菌液，同时迅速加入0.5ml不同稀释度（10-7、10-8、10-9）的噬菌 体裂解液（每个稀释度3皿），摇匀迅速倾于底层为肉汤固体培养基平板上，轻轻摇匀，待 凝固后，置37C培养24h。统计平板上形成的噬菌斑数量，并计算其效价。噬菌体效价（个/ml）=（某稀释度平均噬菌斑数X稀释倍数）宁所取裂解液的毫升数五、实验结果1. 通过肉眼观察噬菌斑的形态。按照实验步骤，经培养后的平板如果有大量噬菌斑出 现就证明被检菌株是溶源菌。2. 计算噬菌体效价。
