65 蛋白质药物运输

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1、蛋白质药物运输1蛋白质药物的研究现状蛋白质药物相比传统的小分子化疗药物具有高活性、高特异性、低毒的优点，迄今已有 130多种被美国FDA批准用于临床治疗心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤等疾病。蛋白质药 物在肿瘤靶向治疗中疗效显著，现已有24种单抗被FDA批准用于治疗各种肿瘤（表1）。其 中，Bevacizumab（贝伐珠单抗）、Trastuzumab（曲妥珠单抗）、Adalimumab（阿达木单抗）和 Rituxilnab（利妥昔单抗）是临床治疗转移性结肠癌、转移性乳腺癌、淋巴细胞白血病和非霍奇 金淋巴瘤的常用药。最近，单克隆抗体如Nivolumab和Pembrolizumab被发现能通过靶向到

2、程序性死亡受体-1 （PD-1）来重新激活T细胞，实现对肿瘤的免疫治疗，现己被批准用于黑色 素瘤和肺鳞癌（肺鳞状上皮细胞癌）的临床治疗。尽管单抗类蛋白质药物在肿瘤治疗中展现出了巨大的潜力，但是这些细胞外作用的蛋白 药物仍然存在在体内不稳定和容易被酶降解等缺点。而细胞内作用的蛋白质药物除了存在这 些缺点外，还有选择性差和难以被细胞有效内吞等问题。最近，多种纳米和微米载体被开发 用来保护蛋白质药物的生物活性和实现蛋白质药物的肿瘤靶向治疗。接下来我们将着重介绍 基于脂质体、聚合物囊泡、纳米凝胶、聚合物纳米粒子和无机纳米粒子等的纳米载体和微球、 微凝胶等微米载体在蛋白质药物靶向递送中的应用。表1 19

3、94-2016年FDA批准的抗肿瘤单抗药物表1 19叫2116年KDA批准的抗肿癌单抗药物F名称公司作用靶点适应症批准时间EdrecolomabCentocorcon-la结直肠癌194RitiuimabRocheCD-20非霜奇金淋巴痛1997TnituziirnaibOenetechHER-2转修乳腺庶1998AlcrnliLziiniabGenzymeCD-52淋巴细胞白血病2001IbritumomabSpectrumCD*20非布奇金淋巴痼2002tuixctanpharmsTbsilumotnabGSKCD-20非霍奇金淋巴榴2003CetuximabmcluncEGFR转移性结直

4、盼癌2004BvacizumabGenetechVEGF转移性靖直肠癌2004PanitiwiumabAmgenEOFR.转移性结腺肖.腐厢20MOfahimurnabGlaxo grpCD-20慢性淋巴性白血病20OTDenosumabAmgenRANK!骨转耕实体痛2010IpilimumabBMSCTLA-4.强色素瘤2011BrentiiximabGenetechCD-50淋巴痛2011PertuzumabGenetechHER-2转秽性乳膘癌2012Ado-tnastyzjmabGenetechHER-2新暮性乳膘癌2013ObinutiizimiabRocheCD-20慢柱.漏巴细

5、抱白布病2013FtaniucininiabImCloneVEGF-2胃癌、非小细胞肺癌2014EloliLZLLirLabBMSSLAMF7多发怪骨航痛2014AbbViePembrolizuinabMerckPD-1黑色素瘤2014NivolumabBMSPEM黑色素痼 蜻状细胞肺癌2014DaratutnumabGenmabCD3&多发性骨髓瘤2015NceitumiimabLillyEGFR转移性非小细胞肺癌2015AlezoltzumabGenetechPALI膀胱痛2016OhntlumsbLillyPDGF-Ra软蛆织肉瘤20162蛋白质疗法及其运输障碍蛋白质像生命的引擎一样，在

6、细胞内执行多种必要的功能，比如酶的催化作用、信号转 导、基因调控以及保持细胞存活与凋亡的平衡等。许多疾病的发生就是由细胞内蛋白质功能 的改变而引起的。自20世纪80年代初，胰岛素作为第一个人重组蛋白开始用于蛋白质疗法后，蛋白质疗 法便成为操纵细胞功能和治疗人类疾病的最安全和最直接的方法。在过去二十几年中，蛋白 质药物（多肽激素、细胞因子和单克隆抗体）作为研究工具已经取得了广泛的成功，成为增 长最快的药物种类之一；许多强大的、潜在的蛋白质药物被发现被制备，包括能够进行代谢补偿的酶、针对细胞内靶点的中和抗体、人工转录因子和基因组编辑酶（图1.1）。Protern FunctionsEnzyme A

7、ntibody Imaging Growlh FactorSignaling TrariscifiptioA Apoptotic Vaccine Factor图1.1几种功能性蛋白质的示意图从治疗的角度来看，蛋白质疗法比基因疗法可能更安全，这是因为蛋白质疗法不涉及随 机的或永久的遗传性改变，只是蛋白质的瞬时表达和瞬态行为。在很多医学应用领域，比如 癌症治疗、疫苗接种、再生医学、治疗功能丧失遗传病和成像等，实现向生物体内特定细胞 和器官运输活性蛋白成为一个非常重要的目标。向细胞内运输活性蛋白时会面临很多障碍，比如，蛋白质注入血清后会变得不稳定，很 快被降解或者失活；由于静电排斥作用，大部分蛋白质

8、也是不可以穿诱膜的。这些障碍主要 是中大多数蛋白质的固有特性导致的，包括蛋白质尺寸大、表面电荷多变以及三级结构脆弱 等。因此，像DNA传递和siRNA传递一样，选择合适的运输载体以护送蛋白进入细胞就变 得十分重要了。利用不同的方法可以将蛋白质装载进多种纳米载体，比如通过化学或遗传修 饰的直接结合，物理吸附以及共价或非共价包封（图1.2）。largel protein图1.2制备蛋白质/纳米载体复合物的三种主要装载方法示意图2蛋白质运输纳米载体蛋白质运输纳米载体主要包括蛋白质载体，脂质胶体系统，聚合物纳米载体和无机纳米 载体。纳米载体的关键功能是充当盾牌保护蛋白质以免其过早降解或与生物体环境相互

9、作用 导致的变性。纳米载体可以通过隐蔽抗原表位的免疫原性和削弱网状内皮系统上受体介导的 摄取作用来增强蛋白质的隐蔽性。此外，纳米载体可以抑制蛋白水解，增大运输蛋白质的尺 寸以减少肾的过滤:纳米载体较高的表面积与体积比也改善了药代动力学和生物分布。纳米 载体的另一个特点是通过可控的合成、装载和简单的生物化学修饰可以改变载体的化学物理 特性，使其灵活性增加；关键的粒子属性如大小、表面电荷和表面配体可以促进细胞的渗透 和内涵体逃逸，以及优化稳定性、靶向特异性和蛋白质的释放动力学。这些纳米载体具有如下优点：1）避免蛋白质在生理环境中过早的降解和变性；2）提高 蛋白质药物的血液循环时间，改善其药代动力学

10、性能；3）纳米粒子的大小、表面电荷和表面 靶向配体可调，可以提高蛋白质药物穿膜能力和靶向能力，并且帮助蛋白质逃离内涵体，增 强蛋白质药物在肿瘤部位的富集，提高药物的利用率。2.1无机纳米载体2.2聚合物纳米载体2.3脂质胶体系统Lipid-based nanocarnersoSclid-ilpidLlgscme邳如图1.5两种类型的脂质胶体系统示意图2.3.1脂质体脂质体是由两亲性的分子如脂质和磷脂组装而成的双层囊泡。脂质体的大小范围在20 纳米至几微米之间。脂质体可以附着在质膜表面，通过胞吞或脂质体的细胞融合作用进入细 胞。不同的脂质体制剂已经被开发用于蛋白质的传递。Zelphati等人开发

11、了一种阳离子脂质体介导的递送系统，这一系统是由一个三氟乙酰化 的脂多胺（TFA-DODAPL）和二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）组成的。各种不同大小和表面 电荷的靶蛋白被成功地运输到贴壁或悬浮细胞的细胞质中。其中，8半乳糖苷酶的细胞内活 性主要是在X-gal染色的细胞中观察到的，而caspase-3、caspase-8和颗粒酶B的内化能有 效地引发细胞凋亡。Zuber等人利用原位二聚体两亲物（CholCSper）和DOPE制备了一个细胞内蛋白质的 运输载体。CholCSper在轻度氧化条件下可以产生二硫键。CholCSper两亲物的化学转化导 致蛋白纳米复合物的稳定化和均一化，这种传递方法有利于

12、蛋白的控释和缓释（图1.6）。图1.6蛋白质和CholCSper胶束之间复杂的自组装过程示意图Fretz等人报导了光化学内化(PCI)技术可以增强脂质体介导的细胞毒蛋白皂草素的内 涵体逃逸。与蛋白/脂质体复合物和光敏剂(TPPS2a)共孵育的人卵巢癌细胞(O VCAR-3) 用不同时长的光照处理以进行光化学内吞。尽管细胞毒性的大小与皂草素的量紧密相关，研 究者们还发现，光照时间的增加会导致更有效的内涵体逃逸，这也是实现有效的胞内传递的 关键。Chiu等人利用从远红外激光器(645nm)发出的单一纳秒脉冲促进基于脂质的纳米载 体的释放。他们向Ba/F3细胞递送O6-烷基鸟嘌吟-DNA烷基转移酶(

13、AGT)融合蛋白以通 过抑制BCR-AB诱导细胞凋亡，BCR-ABL是凋亡通路中的关键激酶。一些商业化的脂质试 剂也被用于蛋白质运输。例如，Humpel等人利用脂质体介导的基因转染试剂(FuGENE6 TM) 和蛋白质递送试剂BioPORTER TM向恶性C6胶质瘤和永生化的脑内皮细胞rBCEC4中运 输促凋亡蛋白caspase-3，在两个细胞系中均观察到了 caspase-3诱导的TUNEL阳性细胞凋 亡。脂质体是一种两亲性类脂双分子层的微小泡，其亲水内腔可用来高效地装载亲水性蛋白 质药物。与其它蛋白质纳米载体相比，脂质体最显著的特点是可以与细胞膜有效融合从而能 快速高效地将蛋白质药物递送到

14、肿瘤细胞内。人们在脂质体蛋白递送方面做了大量的研究， 例如，Lenomand等人报道了基于菠菜内囊体(spinach thvlakoids)的脂质体可有效地包裹电压 依赖性阴离子通道(VDAC)和促凋亡蛋白Bak两种蛋白药物。结果显示脂质体可有效地将蛋 白质药物递送到HCTll6细胞的线粒体，从而激活细胞内的凋亡因子caspase-3。Xu等设计 了一系列阳离子脂类，其可自组装形成脂质体且有效包裹saporin蛋白质。并且载saporin脂 质体对MCF-7、MDA-MB-231、HepG 2和4T1等细胞杀伤效果显著，其中对4T1的IC50 可低至O.9nM。为了在肿瘤靶向部位精确调节蛋白质

15、药物的释放，人们设计了各种响应性 脂质体用于蛋白质的可控递送。例如，用含有双硫键的脂类可制得还原敏感性阳离子型脂质 体，其能实现带负电荷的Cre重组酶和Caspase9： RNA复合物在细胞内的触发释放，从而能高效介导基因重组和基因敲除。为了进一步延长脂质体的循环时间，Fujimoto等将聚乙二 醇(PEG)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以硫硫键相连，并与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和 DOPE相混合制各还原敏感脂质体。该脂质体可在A431细胞内还原降解有效释放包裹的荧 光染料，因此该策略可用于潜在的蛋白质递送。除了还原敏感的脂质体，Kono等报道了一 种pH敏感性的脂质体，其可用以卵清蛋白的细胞内释放和激活树突细胞(DCs)(Figure 1.9)。 该脂质体因修饰的酸敏感的凝胶多糖(curdlan)和甘露聚糖(maIman)，使得该腊质体可在内涵 体酸性环境中触发释放出包裹的卵清蛋白，促进Dcs抗原呈递。此外，羧基化聚多糖还可 通过与Dcs表面Dectin-1和Dect