《离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定【摘要】目的探究新生大鼠脊髓星形胶质细胞的别离、培养与传代及纯化方法，鉴定其培养纯度。方法别离、培养新生大鼠脊髓星形胶质细胞，用换液时暴露结合旋转法加以纯化，酶消化法传代后进展免疫组化鉴定，并染核计数星形胶质细胞的纯度。结果星形胶质细胞贴壁快，多在12h内，3d后数量显著增加；免疫细胞化学染色显示，nf200抗体染色为阴性，提示培养盖片中不含神经元；gfap阳性染色细胞高达95.8%。结论换液时短暂暴露结合恒温旋转法可纯化得到高纯度的星形胶质细胞，是一种简单、高效的星形胶质细胞纯化方法。【关键词】星形胶质细胞；神经微丝蛋白；胶质纤维酸性蛋白purifiatina
2、ndidentifiatinfastrytefspinalrdinvitrenan,lishu-rng,subing-yin(departentfneurbilgy,thirdilitaryedialuniversity,hngqing400038,hina)abstrat:bjetivetexplretheethdfislatin,ulture,andpurifiatinfastrytederivedfrspinalrdfnenaterats,andidentifiedbyiunytheialstain.ethdsastrytederivedfrspinalrdfnenateratserei
3、slatedandultured,purifiedbyexpsedashrttiehenexhangingediuandrtatin.passagethrughenzyedigestinandidentifiedbyiunytheialstain,tuntthepurityeffiientfastryte.resultsastrytesadheredafterplated12h,thenubersinreasedsignifiantlyafter3d.iunytheialstainshed:thereerenneurnnultureversbeausethestainfnf200asnegat
4、ive,hilethepsitiveratefgfapstainasupt95.8%.nlusinhighpurifiedastrytesuldbegtbyexpsedashrttiehenexhangingediuandrtatin,sitisasipleandhigheffetiveethdfrthepurifiatinfastryte.keyrds:astryte;neurfilaent;glialfibrillaryaidiprtein近年，神经胶质细胞astryte，ast已成为神经科学研究的热点之一1，它不仅具有支持、分隔、营养和保护神经元的作用，而且参与了脑的高级功能活动，并在突
5、触形成中起着重要作用2-3。ast的别离、培养方法报道较多，取材部位以大脑皮层为主，脊髓相对较少，纯化方法常以屡次传代为主。因此，有必要对星形胶质细胞的别离、培养与传代和纯化进展系统的研究，并对其培养纯度进展鉴定。1材料与方法1.1试剂与仪器de培养基、d-hank液和胎牛血清fbs皆购自gib公司，l-谷氨酰胺、hehst、胰蛋白酶和小鼠抗神经微丝单克隆抗体nf200抗体购自siga公司，兔抗胶质纤维酸性蛋白gfap、fit标记山羊抗兔igg、trit标记山羊抗小鼠-igg和抗体稀释液皆购自北京中杉金桥生物技术。显微镜型号为lypusbx-60，荧光激发装置为lypusdelbh2-rfl-
6、t3，2培养箱therfra3111。1.2细胞的别离和培养取新生24h内sprague-daleyr大鼠购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，参照arthy等4的方法加以改进。取新生24h内的sd大鼠酒精浴后在无菌条件下取脊髓，置冰浴d-hank液中，别离、剪碎脊髓组织，置离心管中，加10倍0.125%胰蛋白酶，在37下消化15i，用含血清培养基终止消化，过200目筛网，1100r/in离心5in，弃上清，参加de培养基(含10fbs)，轻柔吹打，制成细胞悬液，调节细胞密度为1106/l，接种在252培养瓶中，置37二氧化碳孵箱，每3d半量换液1次。1.3ast的纯化每次换液都
7、要将培养液吸干，使细胞在空气中暴露10秒钟以杀死少突胶质细胞；待细胞根本铺满培养瓶后，在37、280r/in摇18h，倒去培养液并用新颖培养液漂洗3次，将所得纯化星形胶质细胞用二次酶消化法传代，用含血清10%培养液将细胞密度调至1106/l，种植到培养皿中的盖玻片上用作免疫组化鉴定和培养瓶内，每3d半量换全培养液1次，直至细胞交融。1.4ast的鉴定对培养的ast作免疫细胞化学染色鉴定，gfap与nf200抗体作免疫荧光双标，并用hehst染核标识细胞总数，计数ast的纯度。简言之，培养盖片经pbs漂洗2次，4丙酮室温固定10in，pbs漂洗5in4次，加nf200抗体1100050l/盖片，
8、37湿盒孵育1h后4冰箱过夜，pbs漂洗5in3次，trit标记山羊抗小鼠-igg140037孵育1.5h，pbs漂洗5in3次，加gfap抗体1500，以等量的抗体稀释液作为对照，37湿盒孵育4h后pbs漂洗5in3次，fit标记山羊抗兔igg140037湿盒孵育1h后hehst终浓度为1g/l染细胞核5in；漂洗封片后荧光显微镜观察、照相。1.5细胞计数在显微镜下随机选取20个视野，分别计数发蓝光的细胞核数量表示细胞总数，gfap阳性细胞数绿光和nf200阳性细胞数红光，算出平均每个视野中gfap阳性细胞所占细胞总数的比例。2结果脊髓ast原代培养时，细胞悬液接种后贴壁较快，12h时绝大局
9、部细胞都已贴壁，局部细胞已长出细小的突起，24h后胞体发出许多长而分支的突起，胞体较大、胞质较丰富、形状不规那么。3d后数量增加显著，逐步形成网络状连接。培养10d后，细胞根本长满培养瓶壁。传代后细胞生长更活泼，培养7d便可长满瓶壁，很快交融成片状。nf200抗体染色全为阴性，提示培养盖片中不含神经元。gfap阳性染色发绿色荧光，hehst染核为蓝色荧光。染色结果显示：ast形状不规那么，核较大、呈圆形或椭圆形，常偏向一侧，多数细胞突起数量较多且粗短图1，对照盖片中没有阳性染色。细胞计数结果显示：仅4.2%的细胞核没有被gfap着色，提示ast纯度可达95.8%以上。图1ast免疫细胞化学染色
10、3讨论星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多、分布最广的胶质细胞，传统理论认为它对神经元具有绝缘、营养、保护和支持作用。后来，又发现它在中枢神经系统损伤和修复中也具有重要的作用，一方面星形胶质细胞可合成神经营养因子，促进神经再生5；另一方面又合成神经生长抑制因子，如硫酸软骨素蛋白多糖等6，抑制神经再生，尤其是损伤恢复后期形成星胶瘢痕被认为是神经再生的机械性障碍。近年，ast参与突触发生、发育日益受到学者们的重视，被看作是继突触前、后成分之后构成突触的第三成分1。而离体培养是一种较好的研究细胞形态、功能以及神经生物学和神经药物学等的重要方法。因此，有关星形胶质细胞培养的文献很多，但多数是培养大脑皮
11、质的ast培养或细胞株培养，有关脊髓ast培养的资料较少，尤其是其纯化方法和培养纯度的测定报道更为少见。获得较为单一的、高纯度的细胞成分是进展深化研究的根底，因在体ast与其他种类细胞混杂存在，无法完全别离，故高纯度的ast只能通过体外细胞培养来获得，且必须对培养的ast进展纯化方可获得。ast体外培养及纯化常采用植块培养法和别离细胞培养法。前者应用较早，一般以中枢神经系统的白质组织作为植块，但该培养法的最大弊端是难以得到高纯度的ast，现已很少采用；而后者应用较为广泛。本研究参照arthy的方法4，并加以改进，在换液时将培养液吸干，使培养细胞暴露于空气中10秒钟，可以除去其中的少突胶质细胞，
12、因后者在空气中很短时间内即会死亡。同时，当ast铺满培养瓶壁时，因ast贴壁严密，经37、280r/in摇18h后倒去培养液并用新颖培养液漂洗3次，可进一步纯化所得的ast。此外，选用新生大鼠也有利于获得高纯度的ast，因为ast的分裂顶峰发生在动物胚胎晚期及出生以后7，故一般选择出生以后的新生动物8。原代培养时接种细胞的密度可能会与ast的纯化程度有关，一般在原代培养时采用相对较低的接种密度，因神经元不再分裂增殖，且传代后大多会死去。免疫细胞化学技术是鉴定细胞类型的可靠手段。nf200是神经元的分子标志物，本研究中，所有培养盖片均为阴性，说明其中不存在神经元。gfap存在于胶质原纤维中间丝中
13、，且它仅存在于星形胶质细胞中，是鉴定星形胶质细胞的特异性标志物9，本研究中阳性染色发绿色荧光，实验中有95.8%细胞染色阳性，提示ast所占比例可能还要高于这一比例，因为受免疫细胞化学方法局限性的影响，如固定时细胞破裂导致仅有细胞核残留、染色深浅等，实际纯度可能还要高。hehst为染核的荧光染料，能显示培养盖片上的所有细胞核，便于计数细胞总数。总之，本研究所用方法能很好地培养和纯化ast，且具有简单、高效的优点。【参考文献】1araquea,parpurav,sanzgirirp,etal.tripartitesynapses:glia,theunaknledgedparternj.trend
14、sneursi,1999,22(5):208-215.2turnelle,bergstrra,ferreiraa.prgesterne-induedagrinexpressininastrytesdulatesglia-neurninteratinsleadingtsynapsefratinj.neursiene,2022,141(3):1327-1338.3elariahsb,hugheseg,hej,etal.neurtrphinsignalingangneurnsandgliaduringfratinftripartitesynapsesj.neurngliabil,2022,1:1-1
15、1.4arthykd,devellisj.preparatinfseparateastrglialandligdendrglialellulturesfrraterebraltissuej.jellbil,1980,85(3):890-902.5krenznr,eaverl.nervegrthfatringliaandinflaatryellsftheinjuredratspinalrdj.jneurhe,2000,74(2):730-739.6lensl,hlanddr,andersndk.hndritinsulfateprteglyaniunreativityinreasesfllingspinalrdinjuryandtransplantatinj.expneurl,1999,160(1):51-65.7barbing,selaki,anthrpe,etal.usefentralneurnalulturesfrthedetetinfneurntrphiagentsj.neursiene,1984,12(1):33-43.
