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1、碱性磷酸酶 km 实验报告篇一：碱性磷酸酶Km值得测定（1）碱性磷酸酶Km值得测定原理在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【s】增 大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度 最大。关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。将米 氏方程变形为双倒数方程对1/s作图可算出Km步骤，以 1/V结果由y=92961x+1.1465算出当y=0时x=-0.233，继而算出 Km 值=8.11mmol/L讨论计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成 误差，所以导致与实际值差距较大。尿蛋白定性检测原理 加热可以使蛋白质变性，溶液 p
2、h 等于 pI 时溶解度最小。 步骤1. 取大试管一支，加入 5ml 澄清尿液。2. 用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。（: 碱性磷酸酶 km 实验报告）3. 滴加5%乙酸 23 滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。 结果未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显讨论 正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。 尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。分子筛层析（凝胶过滤法）原理 多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离 大分子先出，小分子后出。步骤1. 取 58 滴 4mg/ml 蓝色葡萄聚糖液和 4 滴 2mg/ml 重铬 酸钾液混匀。2. 将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶
3、柱表面加 入混匀的待层析液。3. 从上口缓加蒸馏水，成 23cm 高水柱，出水口用小试 管接水。4. 在上口加洗脱液洗脱。每支小试管接 1cm 液体，并编 号。5. 观察不同小试管的液体颜色的变化。结果讨论分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分 离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。篇二：实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告 实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学 分析实验日期20XX年10月25号实验地点生化实验室合作 者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKp或ALp）是一种底物特异性较低，在 碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离 子为
4、激活剂。AKp具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷 酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接 受体是水，则其作用就是水解。AKp最适PH范围为8. 6- 10,动物中AKp主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清 AKp 主要来自肝，小部分来自 骨骼。AKp 可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的 方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌 中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKp 分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似 常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方 法分离纯化。
5、有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度 的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取 分离AKp。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即 为含有AKp的滤液，AKp能溶于终浓度为33%的丙酮或30% 的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中， 通过离心即可得到初步纯化的 AKp。2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质 具有的酶活性来表示，单位（u/mg?pr ）来表示。因此，测 定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数； b 每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活 性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由
6、碱性磷酸酶催 化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与 4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深 浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程 中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在 37 摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品 蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、PH和酶的浓度一定时，酶促反应速度 与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（V）随底物浓度（S）的增加而迅速增加。若继续增加底 物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种 程度时，反应速度就
7、会达到一个极限值，即最大反引发速度 （Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方 程式表示：式中：Vmax为最大反应速度；s为底物浓度；Km为米 氏常数;V代表反应的起始速度。当v二Vmax/2时,Km=so 因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。 Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶 动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01T00mmol/L。Km和Vmax的测定：主要采用 Lineweaver-burk 双倒数作图法。此式为直线 方程，以不同的底物浓度 1/s 为横坐标，以 1/V 为纵坐标，并 将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相
8、交的负截距为T/Km，由此可以 正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活 性，再根据 Lineweaver-burk 法作图计算其 Km 值。实验以 磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和 磷酸盐。酚在碱性条件下与 4-氨基安替比林作用，经铁氰化 钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。 根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线 上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。二、实验材料 （一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定1、样品兔肝2、试剂0. 5mol/L乙酸镁溶液0. lmol/L乙酸钠溶液 0. 01mol/L乙酸镁一0. 01mol/L乙酸钠溶液 0.0lmol/LTris 0.0lmol/L乙酸镁ph88缓冲液 丙酮（分析纯）95%乙醇（分析纯）正丁醇（分析纯） 0. 04mol/L底物液1 mg/ml分标准液05mol/LNaO H
