色谱柱的使用及维护

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1、液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用，由 于作用力的大小、强弱不同，各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分 析和检测。但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题，因此掌握正确使用和维护色谱柱的知识非常必要。色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压 力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损 坏导致鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有：(1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在

2、双分配效应，即在流动相 与固定相之间进行分配，又在 流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。 当硅羟基 对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时，色谱柱柱 效下降，峰形出现拖尾、变宽。(2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高，无论怎样处理,都会有不少于5 X10- 6的重金属以金属氧化物的形式 残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物，使其被氧化，产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶 素和大多数中药，因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化，影响其分离效果。(3) 碳流失。固定相经长期使用，会有部分碳链被流动相洗脱下来，随流动相一起流出色

3、谱柱外，造成碳流失。(4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时，有时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后，如果没有先用含一定配比的水 相流动相冲洗，而直接用纯有机相冲洗，瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出 盐，将柱子堵塞，使柱压升高，柱效下降。(5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当，使色谱柱中的保存液全部挥发，柱子内部变干,造成色谱柱的损伤，影响分离效 果。2 色谱柱的使用新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。认真阅读说明书及性能测试报告，了解新柱子的最佳性能指标,如某色 谱条件下的柱压、柱效等。有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同，故在分析样品之前，

4、应使用合适的试剂将柱子 中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18柱通过出厂测试后多保存在乙腈中, 可用1020倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高如开始0. 30. 5mL/ min , 1015min后可慢慢加 快。硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相，则使用前须用乙醇或异 丙醇 冲洗，流速0. 10. 3mL/ min，将正庚烷冲洗干净 后，再用流动相平衡。实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等，供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平 衡，待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱

5、用初始流动相平衡。一次样品分离完成后，要有足够的时间使系统恢复平衡，再 进行下一次分析。一般流动相平衡时间为30min ,若系统中有盐或水，平衡时间应延长。3 色谱柱的清洗与保存色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品分子残留在柱子、接头、流通池中，会污染系统，影响对其它样品的分析, 降低柱效。因此分析工作结束 后，要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中，若流动相中无酸、碱、盐类 物质，可用90 %甲醇冲洗3060min，若含酸、碱、盐类物质，则要先用10 %甲醇或乙腈，或用与分析用流动相相同的 比例把含酸、碱、盐溶液换成水，冲洗3060min ,再用5070 %甲醇或乙腈冲洗,最后

6、用100 %甲醇 或乙腈冲洗。若有 四元泵，可用梯度达到90 %的甲醇冲洗。直接用纯甲醇或乙腈冲洗，会导致磷酸盐沉淀于柱子或检测池中。最好也不要 用100 %纯水冲洗柱子。纯水极性很强,ODS填料的硅烷键是非极性的，在纯水中各键合基团会因疏水而改变性能，使 柱效很快降低。目前已有公司推出可以使用100 %纯水的柱子，原理是键合基团互相之间有排斥力,阻止了键合基团性能 的改变。能否用纯水冲洗要看柱子说明书的规定。有机相(如甲醇、乙腈)-水体系流动相能完成大部分析工作，但是 有时分析弱酸或弱碱化合物时(如生物碱)，为消除拖尾现象，需用离子对试剂。常用的离子对试剂有庚烷磺酸钠和十二烷 基磺酸钠，这时

7、常采用p H35的缓冲盐体系。离子对色谱分离结束后，柱子应先用有机溶剂-水体系冲洗，再用水冲洗, 最后用有机溶剂冲洗。假设流动相是甲醇-0. 5 %庚烷磺酸钠(p H3. 3) (VnV = 50n50)，应先用50 %的甲醇水冲洗，然后用 水冲洗，最后用甲醇冲洗。这是因为十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠都是表面活性剂，可以洗掉脂肪油(如烷烃及其衍生 物)。如果先用水冲洗，十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠会将ODS柱胶表面键合的长链烷烃洗脱下来，造成固定相的损 失。如果先用有机相-水体系冲洗柱子，由于表面活性剂在有机相中有一定的溶解度，并且流动相的量比较大，会命名表 面活性剂逐渐溶解在流动相中被冲洗出来，

8、从而减少表面活性剂对键合相的洗脱。十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠冲洗干 净后，可以再用水冲洗，然后用有机相冲洗和保存。不同型号色谱柱冲洗所用溶剂体积见表1。表1色谱柱冲洗溶剂体积色谱柱尺寸(mm)柱体积(mL)溶剂体积(mL)125 x41. 630250 x43. 260250 X1020400色谱柱一般用流动相中所含的有机溶剂来清洗与暂时保存，若长期不用，要用色谱柱说明书中推荐的溶剂保存。如反相 色谱柱可用纯甲醇或乙腈保存，正相柱用烃类溶剂保存,离子交换柱用水或甲醇/水保存。色谱柱的再生若色谱柱柱效严重下降，分离效果变差,可以用10 %异丙醇甲醇冲洗色谱柱。若柱效仍无改善，可 以对色谱柱进行再

9、生。色谱柱再生时，最好使用廉价的泵，而不使用高效液相色谱仪上的泵。再生的关键是了解污染物的性质，并找到合适的溶剂将其去除。如果污染是因强保留物质的累积引起的，可以用流动 相中较强的溶剂(90 %100 %)以相当于20个柱体积的溶剂量清洗污染物。残留 的脂质能用非水溶剂如甲醇、乙 腈、四氢吹喃清洗。如果使用的是缓冲液系统，则要先用无缓冲流动相(即把缓冲液换成水)以相当于510个柱体积 的量冲洗，再更换强溶剂继续冲洗。但有时强溶剂也无法将残留在色谱柱上的污染物洗掉，需要使用更强的溶剂或者多 种溶剂清洗柱子。对于含蛋白质类的 污染物，用0. 05mol/ L稀硫酸冲洗非常有效，流速0. 5mL/

10、min。溶剂与溶剂之 间的组合有很多，有时生产厂家会推荐溶剂系统。清洗、再生所用的系列溶剂都是强度逐渐增加的，通常最后一个溶剂 是疏水的(如醋酸乙酯甚至是烃),可以用来溶解非极性物质,如脂质和油类。清洗过程中必须保证冲洗溶剂之间的互溶 性，清洗过程结束时，必须借助中等强度能互溶的中间溶剂回到初始溶剂系统。异丙醇是一种非常好的中间过渡溶剂，既 能与正己烷或二氯甲烷互溶，又能与水相溶剂互溶。但异丙醇粘度非常大，必须在较低的流速下使用，以免泵压过高。一般 情况下，极性固定相(如Si , NH2 , Diol基色谱填料)的再生可以依次使用2030倍色谱柱体积的正已烷、异丙醇、二氯 甲烷、甲醇冲洗色谱柱

11、(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中随时注意调整冲洗流速)，然后再以相反的溶剂顺序冲洗色谱 柱。非极性固定相(如反相色谱填料C18 ,C18 ,CN等)的再生可依次用2030倍柱体积的甲醇:水=10:90 (V/ V)、乙 腈、异丙醇冲洗色谱柱，然后再以相反顺序冲洗色谱柱。键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。例如典 型的硅胶键合柱，在没有缓冲溶液的情况下，可以用甲醇、乙晴n异丙醇=75n25 (V/ V)、异丙醇、二氯甲烷、正己烷依 次冲洗。用二氯甲烷或正己烷中洗后，考虑到溶剂相容性，柱子必须再用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。四氢吹 喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果柱子

12、被严重污染，可以用二甲基亚砜(DMSO)或者二甲基甲酰铵和水 按50:50的比例混合,用低于0. 5 mL/ min的流速冲洗色谱柱。对N H2改性的色谱柱进行再生时，由于N H2可能以铵 根离子的形式存在，因此应该在用水冲洗后用0. 1mol/ L的氨水冲洗，然后再用水冲洗，直至碱溶液完全流出。另外，大多 数强保留污染物都会累积在柱头上，对柱子反冲可以缩短冲洗时间。当然还要看所用色谱柱是否允许反冲。无论正冲还 是反冲，最好不要接检测器，以免污染物进入检测池。污染物的过多累积会加大清洗难度，清洗柱子频率越高越容易清洗, 所以有规律地清洗柱子，可以预防重大问题的发生。污染严重的色谱柱冲洗无效时,

13、需将柱内填料取出进行处理，或更换 新填料。还可以将柱头入口处被污染的填料取出，重新补装同类型的填料,然后再改变柱流向进行再生。这种逆流再生方 法，可以使大多数柱子性能得到恢复。a#N b r5 色谱柱的维护色谱柱使用过程中不能碰撞、弯曲或强烈震动。当柱子和色谱仪连结时，阀件或管路一定要清洗干净。以下从流动相、 样品、保护柱等方面提出色谱柱维护应注意的一些问题。(1)流动相：流动相使用前必须经脱气和过滤处理。即使仪器配有自动脱气机，也最好采用超声脱气或其它简便的脱气方 法对流动相进行预脱气。尽量避免使用高粘度溶剂(如异丙醇)作为流动相，避免流动相组成及极性的剧烈变化。流动相 应尽量使用色谱纯，减

14、少流动相中杂质对色谱柱的污染和对检测器的影响。水用超纯水，流动相最好用0. 45pm或0. 22pm的膜过滤。大多数反相色谱柱的p H稳定范围是27. 5，硅胶柱p H 8时会发生 硅胶溶脱，键合型柱p H 2时 会发生键合相断裂，流动相尽量不超过色谱柱的p H范围。普通C18柱尽量避免在40 C以上的温度下分析。柱内不 溶物容易引起色谱柱的堵塞，影响样品的分离。不溶物产生的原因是有溶剂的不互溶、样品溶解液和流动相不互溶或 者由于温度改变或固定相干涸而产生沉淀。为避免上述问题，要注意溶剂之间的互溶性。若两种溶剂不互溶，需经过中间 溶剂慢慢过渡。保存时应将色谱柱两端密封，并尽量保持室温恒定。 样品：对内径5pm的柱子，样品需经0. 45pm的膜过滤,更细的柱子要0. 22pm的膜过滤。基体比较复杂的样品需 经过一定的样品预处理，例如海洋沉积物、中药提取液、体液等，需要采用萃取等方法除去对柱子有损坏的较大杂质，例 如色素、多糖、蛋白质等。尽量减少进样量，避免过载。(3)保护柱:最好使用预柱作为保护柱，减少污染物对分析柱的损伤。压力升高通常是需要更换预柱的信号