脂质体转染的实验原理与操作步骤

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1、脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期：2012-06-25来源：互联网 作者：青岚 点击：4751次摘要：细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细_轴 胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细 ？ 胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。&找产品，上生物帮 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、 脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法 是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质

2、体转染的原理和操作步骤等。脂质体(lipofectin regeant, LR)试剂是阳离子脂质体 N-1-2， 3-Dioleyoxy， Propyl-n， n， n-TrimethylaMMoniuM Chloride(DOTMA) 和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1： 1(w/w)。它适用于把 DNA 转染入悬 浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷 酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适 合的用量、作用时间等，对

3、每批LR都要做:第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR 混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从15仇g和孵育时间6小时开始，按这 两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出 转染时间(224小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时 为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体 细胞。一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体(liposome)作为体内和体外输送载体 的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融

4、合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比， 有较高的效率和较好的重复性。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的 阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合 到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细 胞膜表面，经过内吞被导入细胞。二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤方法一:(1) 细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含l2X105 个细胞培养液，37CCO2培养至40%60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细 胞)。(2) 转染液制备：在聚苯乙

5、稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的 量)A液：用不含血清培养基稀释1-10p gDNA，终量100L, B液：用不含血清 培养基稀释2-50gLR,终量100L,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟， 稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所 致，应酌情减量)。(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37C温箱置624小时，吸除 无血清转染液，换入正常培养液继续培养。(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率

6、有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二:以5X105细胞/孔接种6孔板(或 35mm培养皿)培养24小时，使其达到5060% 板底面积。(2) 在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下： 在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。 旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。 室温下放置510分钟，使DNA结合在脂质体上。(3) 弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加 入1mL DNA/脂质体复合物，37C培养35小时。再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养1424小时，(5) 吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜1

7、0%FCS的DMEM，2mL/孔,再培养2448 小时。(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。3、稳定的脂质体转染方法如下：(1) 接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2) DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3) 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37C培养48小时。(4) 吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染 克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。三、个人经验：本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细 胞。(别的方法可以参考生产商提供的protoco

8、l)1、转染前1天将0.52X105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生 素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达9095%。2、准备复合物(1) 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。(2) 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻 浑匀，室温孵育5分。注意：必须在25分内进行。(3) 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。3、吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。4、将复合物(总体积100u l)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。5、将细胞放入培养箱孵育46h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不 用)。6、2448h后可以观察转入基因表达情况。7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1： 10(或更高比例)传代，1天后 更换筛选培养基筛选。8、优化：要保证细胞汇合率达9095%(比较高)；DNA/Lipofectamine2000比率 1： 0.51： 5，一般细胞1： 23.脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率 相对较高、对基因片段大小的限制较小等，但是阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件: 脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。