试验一蛋白质含量的测定

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1、n实验局部实验一蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的根本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最根本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法 Biuret法、Folin -酚试剂法Lowry 法和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝 法Bradford法。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比拟复杂，但较准确，往往以定氮法测定 的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不

2、能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为 一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完 美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确 度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法Bradford法，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏Kjeldahl 定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨消化，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度 可计算得样品之氮含量。假设以甘氨酸为例，其反响式如下：CH2COOH+ 3H2SO4

3、2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH 3 1NH22NH 3 + H2SO4 一，(NH 4)2SO4(NH 4)2SO4 + 2NaOH 一2H2O +Na2SO4 + 2NH 3反响1 、2在凯氏瓶内完成，反响3在凯氏蒸储装置中进行。为了加速消化，可以参加 CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用 硼酸溶液，滴定那么用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6. 25即得。五种蛋白质测定方法比拟如下:方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法Kje

4、dahl法灵敏度低，适用于0.21.0mg 氮，误 差 为*%费时810小时将蛋白氮转化 为氨，用酸吸 收后滴定非蛋白氮可用三氯 乙酸沉淀蛋 白质而分 离用于标准蛋白 质含量的准确 测定；干扰少； 费H、J人长双缩脉法Biuret 法灵敏度低1 20mg中速2030分钟多肽键+碱性Cu2 + T紫色络合物硫酸俊；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50100Mg快速510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280nm处的光吸收各种喋吟和嚅嚏；各种核甘酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin 一酚试 剂法Lowry 法灵敏度局5M

5、g慢速40 60分钟双缩脉反响；磷钥酸一磷鸨酸试剂被Tyr和Phe复原硫酸俊；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇消耗时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯是蓝法Bradford法灵敏度最高1 5Mg快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不 同蛋白质变化二、双缩脉法(Biuret法)(一) 实验原理双缩服(NH3CONHCONH 3)是两 个分子脉经180c左右加热，放出一个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中，双缩脉与CuSO4形成紫色络合物，称为双

6、缩脉反响。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都 有双缩脉反响。1H2010=C .、! 111C=oHN1NHR-CH 11! CH-R0=C1L1 土 *CuC=0，Iff 1* _K I 1 1HN -R-CH1 i1 1NHCH-Rh2o紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无 关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸俊、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脉法常用于

7、需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测 定。(二) 试剂与器材1. 试剂：(1) 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白( BSA)或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml的标准蛋白溶液，可用 BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有 需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用 0. 05N NaOH 配制。(2) 双缩脉试剂：称以 1.50克硫酸铜(CuSO4 - 5H2O)和6.0克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6 4H2O)，用500毫升水溶解，在搅

8、拌下参加 300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。假设贮存瓶中有黑色沉淀出现，那么需要重新配制。2.器材:可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。(三) 操作方法1. 标准曲线的测定：取 12支试管分两组，分别参加 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后参加4毫升双缩脉试剂。充分摇匀后，在室温(2025C)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收 值为纵座标绘制标准曲线

9、。2、 样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。 注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin 酚试剂法(Lowry法)(一) 实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于 其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购)，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脉方法是相同的，只是参加了第二种试剂，即Folin -酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反响产生深兰色的原因是： 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin 一酚试剂中的磷钳酸盐一磷鸨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸

10、残基复原，产生深兰色(钳兰和鸨兰的混合 物)。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin-酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的根本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脉法灵敏得多，缺点是费 时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干 扰物质较多。对双缩脉反响发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反响。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸俊、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%)，硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%), 乙醇(5%),乙酰(5

11、%)，丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时， 必须作校正曲线。含硫酸俊的溶液，只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液，即可显色测定。 假设样品酸度较高，显色后会色浅，那么必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时，加 F olin-酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述复原反响只在 pH=10的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜一蛋 白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钳酸一磷鸨酸试剂被破坏之前，复原反响即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5地。通常测定范围是 20250吨。(二) 试剂与器材1试剂(

12、1)试剂甲:(A) 10 克 Na2CO3, 2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠(KNaC4HQ6 4田0)。溶解于500毫升蒸储水中。(B) 0.5克硫酸铜(CUSO4 5H2O)溶解于100毫升蒸储水中，每次使用前，将 50份(A)与1份(B)混合，即为试剂甲。(2)试剂乙：在2升磨口回流瓶中，参加 100克鸨酸钠(Na2WO4 - 2H2O) ,25克钳酸钠 (Na2MoO4 2H2O)及700毫升蒸储水，再加 50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充 分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，参加150克硫酸 锂(Li2SO4), 50毫升蒸储水及数滴液体漠，开口继

13、续沸腾15分钟，以便驱除过量的漠。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体漠的步骤)。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚猷作指示剂，然后适当稀释，约加水 1倍，使最终的酸浓度为 1N左右。(3)标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸储水，浓度为 250 Pg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水假设混浊，可改用 0.9 % NaCl溶液。2. 器材(1) 可见光分光光度计(2) 旋涡混合器(3) 秒表(4) 试管16支(三) 操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分 成两组，分别参加0, 0.1

14、, 0.2, 0.4, 0.6,0.8, 1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250Mg/ml)。 用水补足到1.0毫升，然后每支试管参加 5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于 室温(2025C)放置10分钟。再逐管参加 0.5毫升试剂乙(Folin-酚试剂)，同样立 即混匀。这一步混合速度要快，否那么会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反响的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管参加5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管参加5毫升试剂甲， 2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后假设已超过10分钟，那么第1支试管可立即参加 0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管参加0.5毫升试剂乙，2分钟后 加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30分钟，然后开始测 定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面 的表格。表中是每个试管要参加的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的顺序，逐管参加。最下面两排是计算出的每管中蛋白质