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1、利用siRNA对B细胞上胰岛素受体的抑制作用【摘要】 目的：利用siRNA抑制B 3细胞中胰岛素受体基 因的表达方法：化学合成胰岛素受体（IR）基因的4对特异siRNAs（实验 组1组,d）组R0 3组组）和1对非特异siRNA（NC组）.通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染B W 3细胞,24 h后荧光显微镜 下观察不同浓度siRNA转染细胞的效率；应用逆转录PCF检测IR mRNA表达.结 果：50,100,150,200 nmol/L siRNA 转染B工 3细胞24 h后,转染效率分 别为（土）%,（ ）%,（ ）%,（ ）%,选择100 nmol/L浓度作为siRNA转染浓度. 转
2、染100 nmol/L siRNAs 24 h 后，与对照组相比BRJ丨点3/组B TC ：） 细胞IR mRNA表达都有不同程度下调，其中以8 i IftA 2组抑制效果最为明显， 表达减少了 %.结论：靶向IR mRNA的siRNA能在体外特异性的抑制IR的表达， 为进一步研究B细胞上IR的功能提供了实验基础【关键词】 受体，胰岛素;RNA,小分子干扰；RNA干扰;转染0引言胰岛素受体（insulinreceptor, IR）编码基因突变可直接导致胰岛素作用的降低,IR基因及蛋白表达量下调或IR降解增加可导致胰岛素分泌障碍.有 研究2-3表明B细胞上有IR和4种胰岛素受体底物蛋白UKS）
3、1上小,4及其 下游的转导蛋白表达 B细胞中的胰岛素信号转导蛋白可以被葡萄糖或直接被 胰岛素刺激所活化，B细胞也是胰岛素作用的靶细胞但是通过RNAf扰技术阻 断B细胞上IR后对2型糖尿病发病机制的相关研究还较少.我们利用RNAf扰 技术，以IR基因为靶点，设计了 4条小干涉RNA（siRNA）,期待找到可以明显干扰 B细胞上IR表达的siRNA片段,为进一步探讨B细胞上IR在2型糖尿病发病 机制中的作用提供实验基础1材料和方法材料细胞培养基RPMI1640美国Gibco公司）;胰蛋白酶,Trizol和脂质 体转染试剂Lipofectamine 20XX（美国Invitrogen 公司）;胎牛血
4、清（杭州四季青 生物材料有限公司）;反转录相关试剂（Fermentas公司）;2 x Taq PCR Master Mix（北京天为时代科技有限公司）;PCR扩增引物由上海捷瑞生物有限公司合成. IR引物:上游引物下游引物C乩扩增产物为737 bp. GAPDH引物：上游引物,5 AAT TCA ACG GC：A CAG TCA AGG C:下游引物，了 GGA TGC： AGG GAT GAT GTT CTG G 3,扩增产物 467 bp.方法的设计、合成与配制根据 Gen Ba nk获得小鼠IR基因(Ge nBank登录 号:NM_010568)的cDNA序列,从Ambion公司提供的上
5、设计工具 siRNA Design Tools (:s:/teehlib/mise/)参照siRNA设计原则挑选4条特异性寡核苷酸序列作为靶序列(Target Sequenee, TS),分别为:TSI帥;GCI G(MT(； 财 T口A 3; :TS2 5r AGA TTA TCT T/W AC；T GGA A 3; :TS3 5r GGA CCA TGC CTG AAG CTA A 3 :TS4 5 GGA TCG AGT TCC TCA ATG A :V :并进行全基因组 扫描(BLAST)和序列同源分析(通过NCBI提供的基因组数据库和分析软件进行), 确保选择的siRNA序列与基因组
6、中其他基因无明显同源性.siRNA目的序列委托 上海吉码生物有限公司合成，并同时合成与IR基因序列无关的siRNA作为阴性对 照(negative control, NC),阴性对照正义链的5端有FAM荧光标记.合成序列如下:口加 1正义链:5 GAG GCL GCA (；I.IG由H 初TdT ；盯、反义 链：yI丄mcm批 ecu3：川金 2 正义链：亍 a(.;a ,i.ara LAA Ad GGA AcTdT 反义链：亍 m AAG Al ：A Al.：(.：I. di； cl A3 正义链:夕 G(壮 CCA UGC CU； AA(； CLAAd?dT反义链:Y I LA CCL.
7、L.CA GGC V.C GI.C CilGilG 3r : siKVA :正义链 3 G(；A ,(.：G AGU UCC UCAUG切T匸 3，反义链 心 IJ.IG .说;AAC： 1.(.1；UlfXdCdr 3! ;c 正义链：5 FAVI ULC UCC GAA 工 ACG UTT反 义链:5 ACG L(iA (；AC： GI.IL 曲 A(.-A AT I :V * 配制:用 150 卩 L 无核酸酶水 稀释nmols的siRNA,终浓度为20卩mol/L分装，-70C保存.细胞培养小鼠胰岛B细胞瘤MC 3细胞株由本科实验室保存，于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培
8、养液37C ,5 0 mL/L CO2条件下培养，隔日传代.转染将对数生长期的 MC ：5细胞按3X 105个/孔接种至6孔板，用无 抗生素的100 mL/L胎牛血清培养液培养,24 h内细胞生长达培养孔底面积40%60% 时进行转染.实验分空白对照组，不做任何处理；阴性对照组转染与IR基因序列 无关的siRNA;siRNAs实验组分别转染曲 丨，厲讥1 2, siRNA久每组3个复孔.用Lipofectamine 20XX转染，按说明书操作进行，使siRNAs终浓 度除剂量实验中浓度为 50,100,150,200 nmol/L 夕卜，其余均为100 nmol/L. 在 37C,50 mL/
9、L CO2条件下培养4 h后补加含血清、不含抗生素的正常培养液mL.转染效率的检测预先在六孔板中放入盖玻片，接种细胞，转染siRNA 24 h后，取出盖玻片置于载玻片上,950 mL/L甘油封片，荧光显微镜下观察不同剂量 siRNA转染细胞效率.分别在自然光和荧光激发光源下观察转染的细胞，每组10个视野记数绿色荧光细胞数与白光下总细胞数的百分比，取其平均值作为转染效卩检测IR mRNA基因转录水平实验参照说明书进行.用Trizol提 取各组转染后细胞总RNA取2卩g RNA用） 站 逆转录酶合成cDNA以cDNA为 模板PCR扩增IR片段,25卩L反应体系:cDNA模板3卩L,2 X PCRM
10、ix卩L,上、 下游引物各1卩L（10卩mol/L）,ddH2O 卩L.反应条件（35个热循环的参数）:94 C 45 s,57 C 30 s,72 C 60 s,共 35 个循环;GAPDH为内参照.PCR 产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，通过自动凝胶成像分析系统，将电泳结果进行扫描分析统计学处理：计量资料以xs表示,组间比较使用软件进行方差分析及NPar Test.2结果转染效率分析荧光标记的NC组转染细胞24 h后,在50,100,150,200 nmol/L 浓度下转染效率分别为（）%,（ ）%,（ ）%,（ ）%（图 1）. 50 nmol/L NC 组与100,150,200
11、 nmol/L NC 组转染效率比较差异均有统计学意义（P）,而后3 组两两之间比较差异无统计学意义，故选择100 nmol/L作为转染siRNA的实验浓 度对IR基因表达的抑制提取转染100 nmol/L siRNAs 24 h后各组细胞的 总RNA用RT卩（JR测定对IR基因表达的影响.IR基因扩增产物为737 bp;内参 照GAPD扩增产物为467 bp.与空白对照组相比siRXA丨、2,帚.组B :？ 细胞IR mRNA表达都有不同程度下调，其中以S i RA 2组干扰效果最为明显，表 达减少了 图2）.3讨论研究发现，B细胞胰岛素受体基因敲除（B IRKO）小鼠出现了与人2型 糖尿病
12、发病初期相似的临床特征：葡萄糖刺激的胰岛素第一时相分泌丧失 80% 以上,雄性B IRKO小鼠的葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）几乎完全消失，雌性 B IRKO小鼠GSIS极度迟钝，同时伴有胰岛素水平降低，但对精氨酸刺激的反应 仍然保持.表明B细胞的胰岛素受体对维持葡萄糖刺激的胰岛素第一时相分泌 是必不可少的.而过度表达B细胞上胰岛素受体后，葡萄糖刺激后的胰岛素分 泌较对照组明显增加.因此对B细胞上IR的相关研究可以为2型糖尿病的发病 机制提供一定的依据.A,B: 50 nmol/L NC 组;C,D: 100 nmol/L NC 组;E,F: 150 nmol/L NC 组；G,H: 20
13、0 nmol/L NC 组;I,J: 空白对照组.A,C,E,G,I: 荧光下 B TC :？ 细胞；B,D,F,G,J:白光下B TC 3细胞.图1不同浓度siRNAs转染B TC 3细胞的转染效率FAMX200（略）组组组;4:s i RA 1 组；5: NC 组;6: 空白对照组.A: IR mRNA; B: GAPDH mRNA.图卵T卩CR检测转染siRNAs后各组细胞IR mRNA的水平(略)RNA干扰是最近发展起来的一种抑制特定基因表达的新方法，它是通过 双链RNA勺介导特异性地降解相应序列的 mRNA阻断相应基因表达的转录后水平 的基因沉默机制在哺乳动物细胞介导RNAi效应的主
14、要是siRNA分子，其大小约 2123 bp.瞬时转染化学合成的siRNA时，不同的siRNA浓度可以引起靶基因水 平不同程度的下调,因此，我们通过选择带有FAM标记的阴性对照，选择100 nmol/L作为转染siRNA的实验浓度.不同的siRNA对基因的下调有序列选择性，因此在本实验中我们设计了 4条不同靶序列的siRNA片段,在mRN水平分别检测了 4条siRNA片段的抑制效 果,其中s i RA 2组的抑制效果最明显,表达减少了 %.这为此后的细胞功能研 究奠定了基础.【参考文献】Ohsiigi M, Crci.sCT ZIk.hi Ys et 汨，deduced expressi on
15、 ofthe insulin receptor in mouse insulinoma (MIN6) cells reveals multiple roles of in suli n sig nali ng in gene expressi on, proliferati on, in suli n content, and secretion J. J Biol Chem, 20XX, 280(6):4992-5003.Verspohl EJ, Ammon HP. Evidenee for presenee of insulin receptors in rat islets of Lan
16、 gerha ns J. J Cli n Inv est, 1980,65(5):1230-1237.Harbeck MC, Rothe nberg PL. A tech nique for isolati ng sin glecells for analysis+by reverse transcriptionpolymerase chain reaction J.Anal Biochem, 1995,230(1):193-196.Roper MG,Qian WJ, Zhang BB, et al. Effect of the insulin mimetic I. 783s 281 on iul
