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1、镍柱蛋白纯化一、原理镍柱里面含有琼脂糖微球体，在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与 Ni2+发生螯合，螯合后的Ni2+能与HIS上的咪唑环发生特殊的相互 作用，从而实现蛋白质的分离。影响蛋白质/多肽与金属离子鳌合力 大小的因素主要是蛋白质表面可结合的氨基酸（种类、数目和分布）、 金属离子的种类和密度、层析条件（pH、盐的种类和浓度、添加剂等）二、缓冲液的配制（500mlPH=7.4）BindingWashingElutionPB50mlNacl14.625g20mM咪唑1.8gPB50 mMNacl14.625g5mM0.45g10 mM0.9g15 mM1.35g20 mM1.8g40Mm3.6
2、gPB50mlNacl14.625g100 mM9g200mM18g400mM咪唑45g600mM咪唑63gbuffer:550mM)buffer:buffer:三、操作步骤此步骤过镍柱的所有溶液、上清蛋白都要先用滤膜过滤，所有液体 过镍柱的速度要严格控制2.5ml /min,中间镍柱不能进气泡1、5倍镍柱体积去离子水洗涤，去除空气和20%乙醇 (5ml /min)2、510倍镍柱体积Bin di ng buffer平衡3、上蛋白样品4、5倍镍柱体积Wsahing buffer洗脱杂蛋白(HIS标签含有6个组氨酸，结合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白)，此步骤设洗脱梯度5、5倍镍柱体积Eluti
3、on buffer洗脱目的蛋白，此步骤设洗脱梯度6、5倍体积去离子水清洗掉缓冲液7、20%乙醇保存于4C注意：洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来四、葆柱重生(介质使用约3-20次，具体与原料来源、样品体积等有关)1. 镍柱用去离子水清洗2. 5 倍镍柱体积 EDTA 重生镍柱(20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTApH 7.4)3. 5倍体积 Binding buffer 平衡4. 5倍体积去离子水清洗5. 20倍体积 1M NaoH 洗涤6. 水洗至中性7. 5倍柱体积挂镍8. 用5倍体积以上的纯水清洗层析柱，去除游离的金属离子9. 20%乙醇保存4C
4、五、注意事项1、推荐在中性至弱碱性的条件下（PH78）结合重组蛋白，磷酸盐Buffer是常 用的缓冲液，Tric-c l在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度2、避免在Buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂3、若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有Buffer中添加6M盐酸胍或8M尿素4、避免缓冲液中有高浓度的供电子基团，如：NH4,甘氨酸，精氨酸，Tris5、各种Buffer中不能含有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价NI被还原6、不能含有离子型的去垢剂，比如SDS,防止Ni流失7、Buffer里可加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘 油浓度可高达50%8、Buffer中Nacl浓度应在300 Mm 2M之间9、可加入非离子型去垢剂友情提示：本资料代表个人观点，如有帮助请下载，谢谢您的浏览！
