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1、冰冻切片HE染色步骤一、操作方法及步骤： 取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24X24x2m。 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在510um间。二、冰冻切片时的注意事项： 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要
2、每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰
3、晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片
4、来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。三、冰冻切片的快速染色方法：切片固定30秒1分钟。水洗。 染苏木素35分钟。 分化。 于碱水中返蓝20秒。 伊红染色1020秒。 脱水，透明，中性树胶封固。冰冻组织12分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。常规方法：冰冻切片固定1030s稍水洗12s苏木精液染色(60C)3060s(4)流水洗去苏木精液510s(5)1%盐酸
5、乙醇13s(6)稍水洗12s(7)促蓝液返蓝510s(8)流水冲洗1530s(9)0.5%曙红液染色3060s(10)蒸馏水稍洗12s(11)80%乙醇12s(12)95%乙醇12s(13)无水乙醇12s(14)石炭酸二甲苯23s(15)二甲苯(I)23s(16)二甲苯(II)23s(17)中性树胶封固。注：第(14)步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。封片切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。在整个染色过程中不让切片干涸：切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。
