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1、细胞的细菌、真菌污染及排除Edit By Waiti ng.D真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培 养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、抱子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在 培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊， 倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培 养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细 胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底 外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢
2、，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使 细胞脱落死亡。真菌污染细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（|jm）计。常见的污染细菌有革兰氏阴性 菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染 较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现 象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下 观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细 菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加 双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100
3、rpm离心5min,沉淀中加入无抗 生素的培养液2ml,置于37C培养，24h可得结果。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒 增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株（系）丢失。细菌污染细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多 再发生污染48h以内就已明显。在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有 利于及时采取措施予以补救或排除。培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的 或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱（若发现真菌污染，可在污 染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理）（具体操
4、作方法可参考细胞培养污染的预防），复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采用5 10倍于常用量的抗生素冲击，加入高浓度抗生素后作用2448h,再换入常规培养液，有 时可能奏效。细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。常用抗生素用量和效应抗生素抗菌谱浓度（量/mL）细菌真菌支原体青霉素G+100lOOOu链霉素G-100 lOOOug庆大霉素G+ /G-+50200 ug四环素G+ /G-+1050ug卡那霉素G+ /G-+100 1000 ug两性霉素+常用2ug/mL制霉菌素+常用 25ug/mL+表示效应程度高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂
5、量反应实验确定抗生 素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌 素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生 素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25, 0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4. 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2 3 代。5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6. 重复步骤4。7.在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。
