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1、乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后3d 内所分泌的乳汁。科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源之一。包括重要的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG） 、乳铁蛋白（LF）及胰岛素生长因子（IGF）等，含量比常乳高10100倍。这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等生物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”， 是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。LF 的一级结构是一条多肽链，分子量为 7080kD, LF上结合有两条糖链，含量为 7%左右，其组成包括有半乳 糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺、藻糖
2、等。LF具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂质过氧化等。在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml ，比常乳高近50 倍。我国约有乳牛近430万头，其中成年母牛260 万头，以每头乳牛年产初乳50kg 计算，每年可产近130t 乳铁蛋白，因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富，它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益。但牛初乳具有异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊之外，利用率非常低。初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。因此， 高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度、高活性的天然活
3、性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重要的现实意义。本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的。1 原料与器材1.1 原料与试剂牛初乳：乳牛产犊 3 d内收集的样品， CM-Sephadex C-50 :进口分装 BMK （Shanghai） Sci & Tech Ltd , CM-SEPHAROSE FAST FLOW, LF标准样品、电泳级丙稀酰胺Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺 Bis、分析纯Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），化学纯SDS （十二烷基磺酸钠）， 分析纯TEMED （四甲基乙二胺），过硫
4、酸胺Ap,分析纯甘氨酸，考马斯亮蓝 R-250等。 1. 实验仪器SBS-100 数控计滴自动部分收集器、HD-21-88 核酸蛋白检测仪、3057 PORTABLERECORDER、 BT01-100 兰格恒流泵、TH-500 梯度混合器、PHS-25 型 pH 计、 DYY-8B 型稳压稳流电泳仪、DYin 28A型电泳槽、751G分光光度计、TDL-5000B冷冻离心机。2 实验方法2.1 分离方法2.1.1 凝胶的预处理取液体胶与去离子水1： 1 混合，浸泡，沉降装柱。以2BV 的流速先用碱洗2.5h （ 5 倍胶体积），用去离子水洗至 pH值为7.0左右，用酸洗2.5h,用水洗至pH
5、值为7.0左右，再 用碱洗 2.5h ，后用水洗至pH 值 7.0 左右备用。2.1.2 牛初乳的脱脂取新鲜牛初乳在冷冻离心机中离心30min （4 800r/min , 15C）,去上层油脂。2.1.3 阶跃洗脱的方法1.6%NaC图 1 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 冼在4c条件下动态上柱吸附 8h。去离子水以1BV的流速洗柱约10h,待基线走平，用1.6%NaCl洗脱2需5h,期间杂蛋白被洗脱下来，待基线再度走平，使用 5.0%NaCl洗脱, 洗脱产物为LF （粉红色），出峰时间为1h左右。洗脱曲线见图 1。2.1.4 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 的穿透
6、曲线（图 2）4小时16分钟5小时5分钟图2穿透曲线在实验中利用纯度为 97%标准样品配制浓度为 4.80g/l的LF溶液，在约5BV流速下测定胶体积为62ml的CM-SEPHAROSE FAST FLOW的穿透曲线。根据洗脱记录可计算得到在穿透点到达前，CM-SEPHAROSE FAST FLOW的实际吸附容量为 2g左右。2.1.5 透析取洗脱液于透析袋，放在蒸储水中24h,中间每8h换一次水，除去洗脱液中的盐类小分子。2.1.6 干燥冷冻干燥法，此法对乳铁蛋白的生物活性损失小。2.2 分析方法2.2.1 蛋白质测定用核酸蛋白检测仪测定蛋白质。2.2.2 乳铁蛋白纯度的分析用HPLC法和凝
7、胶电泳法进行纯度分析。3结果与分析3.1 交换剂的选择根据乳铁蛋白的特性，本实验选用弱酸性阳离子交换剂，并选用 Na型交换剂作为贮存、吸附时的离子型。比较了 CM-SEPHADEX C-50和CM-SEPHAROSE FAST FLOW 2种树脂的 分离效果。表 I CM-5EPHADEX C-50 与 CM-5EPHARO5E FF 洗脱身比较离子交换剂初乳体积 洗脱摘本程洗脱液中LF浓度咯）LF/TL牛初乳LF的纯度国）CM-SEPHADEX C-5D2451.340.41594.92621.610.50096.9从表1可以看出，相同单位量的牛初乳原料进行实验，CM-SEPHADEX C-
8、50和CM-SEPHAROSE FAST FLOW 相比，洗脱得 到的 LF的量和纯度 都相差 不大，只是 CM-SEPHADEX C-50得至U的洗脱液呈较深粉红色，而用 CM-SEPHAROSE FAST FLOW洗脱 得到的洗脱液颜色略浅一些。使用相同的装柱方法时，CM-SEPHAROSE FAST FLOW比CM-SEPHADEX C-50更容易操作，且在实验过程中体积不会发生变化，有利于实现工业化生产。同时由于装柱过程对洗脱效果也有相当程度的影响，故后继实验选用CM-SEPHAROSE FAST FLOW为交换剂。3.2 吸附方法的选择（见图 3）65 -64，1* t ，12345
9、6789时间（L）T-静态吸附一一动态吸附图3两种吸附方法的pH值变化离子交换色谱的吸附方法主要分为静态吸附与动态吸附2类。静态吸附需要的时间比较少，但是无法实现连续操作， 只能停留在实验室小规模提取阶段， 缺乏工业化生产的可能性。 而动态吸附比较容易实现产业化，需要的时间一般随原料的量而变化。2种吸附方法在后期的 pH值基本保持稳定，说明牛初乳具有良好的缓冲功能。由于静态吸 附后的吸附剂难于装柱，故选用动态吸附法。3.3 吸附速度的选择由于在工业化生产中为了提高生产效率，必然在不影响产品得率的前提下降低生产周期。而牛初乳的上柱吸附时间在整个生产环节中占了很大的一个比例。尽可能的提高牛初乳的吸
10、附速度成为工业化生产的必然选择。由于吸附速度受牛初乳的理化性质及离子交换柱的径高比等因素的影响，本实验只在现有条件下比较了3种不同吸附速度的效果比较。从表2我们可以看出3BV和5BV两个吸附速度的产品得率相差不大，7BV的收率偏低，估计已超过穿透速率。故选用5BV的吸附速度。表2 3种吸附速度的LF得季比较吸附速度 初乳体积 洗脱液体积（匐）洸脱液的LF浓度盛）LF/1L牛初LF的纯度%）3BV2671.49CL50096.95BV2620.48695.87BV2420.31395.63.4 洗脱方法的选择洗脱方法中，最常用的是阶跃洗脱与梯度洗脱法。2组梯度洗脱实验，分别使用5%NaCl以及1
11、0%NaCl的浓缩液，稀释液均为去离子水。表3降跳洗脱与梯度洗脱成果比较洗脱方法初乳体积（I） L洗脱液体积（ml1洗脱液中LF法度（验LFJIL牛初乳（I） LF纯度（驰）防碳洗脱2621.610505梯聊脱32000.400.16a i.T梯度洗脱（lO%NaCl）5IBO0.500.1B33.65球1梯圜嫌图4 5%NhCI梯度洗脱曲线10%NaCl梯度洗脱图5 10%XaCl梯度洗脱曲线表3中可以看出，阶跃洗脱的效果要好于梯度洗脱。从洗脱曲线上（见图4、图5）可以看出，梯度洗脱的梯度没有掌握好，峰都重叠在了一起，没有达到要求的分离度。可能是 梯度太小，从而流动相的浓度增大，速度太小，峰
12、型过宽，影响了最终的分离度。从洗脱曲 线上也可看出，随着梯度洗脱的梯度的增大，峰型变得窄一些和陡一些，洗脱效果也有所提 （Wj。3.5 产品的透析和冻干（见图 6、图7）洗脱液经透析24h后冷冻干燥，得 LF固态产品。样品 fiW510图6乳铁蛋白产前的SDSPACE电源园语图7产品的高效液相色谱图4结论本文主要对牛初乳中乳铁蛋白LF分离纯化的工艺进行了研究，并对其工艺流程实现了优化。得到最佳洗月工艺：使用 CM SAPHAROSE FAST FLOW装柱，再转化为 Na型，然后 用脱脂牛初乳作为原料，用 200目滤布过滤后，在 4 c下以5BV动态吸附上柱。吸附完毕 后，先用去离子水以 1BV的流速洗柱，约10h,待基线走平，然后用 1.6%NaCl以1BV的 流速洗脱，约需5h,期间杂蛋白被洗脱下来，待基线再度走平，使用 5.0%NaCl以1BV的 流速洗脱，洗脱产物为 LF （粉红色溶液），出峰时间为1h左右，洗脱液经透析后冷冻干燥 得LF产品，纯度达到 95%以上。
