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1、正交试验优化三叶青叶总 酚类成分的提取工艺【摘要】目的：研究三叶青叶总酚类的提取工艺。方法：回流提取法，以 总酚类提取率、得膏率为评价指标，采用单因素结合正交试验设计法，优化提取 工艺影响因素包括料液比、提取时间、乙醇体积分数和提取次数。结果：三叶青 叶总酚类提取最佳工艺为：回流提取法，提取时间120 min,提取3次，料液比 1：25，乙醇体积分数70%。结论：采用单因素结合正交试验设计法考察三叶青总 酚类成分的提取工艺，获得其最佳提取工艺参数，为三叶青叶总酚类的开发利用 奠定实验基础。【关键词】 三叶青叶正交实验总酚类 提取三叶青，葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(Tet ras tigma
2、hemsleyanumDiels et Gil g)w，全草均可入药，是我国使用历史悠久的中草药，畲医称之为 “一粒珠”，又名金线吊葫芦，是我国独有珍稀濒危药用植物2。根据古医籍记 载，三叶青可祛风除湿、消肿止痛，主要用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎等疾病 3。前期课题组实验研究发现，三叶青叶的酚类成分含量较高4，并且现代药理 研究表明三叶青总酚类成分具有抗肿瘤、抗氧化、治疗心血管疾病、抗炎、抗病 毒、抗感染等多重药理活性5-7。但是对于三叶青叶总酚类的提取工艺研究较少 故本研究以前期构建的三叶青叶中8种特征性酚类成分4：新绿原酸、绿原酸、 隐绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡
3、荆苷的含量测定 方法，结合总酚类含量和浸膏得率为评价指标，通过单因素结合正交试验优化三 叶青叶总酚类成分的提取工艺，为提高三叶青酚类成分的开发利用提供实验依据。1材料与仪器1.1 药材 “闽选一号”三叶青叶（种植基地：三明宁化），经福建中医药 大学药学院药用植物学实验室范世明高级实验师鉴定为三叶青（Te tras ti gma hemsleyanun）的干燥叶，样品存放于福建中医药大学药学院标本室。经粉碎， 过40目筛，备用。1.2试药与试剂 牡荆苷（批号：MUST-0358）、异牡荆苷（批号：MUST- 0681 ）、异荭草苷（批号：MUST-0324）、荭草苷（批号：MUST-0323）、
4、牡荆素 鼠李糖苷（批号：MUST-0357）、隐绿原酸（批号：MUST-0024）、新绿原酸（批 号：MUST-0023）、绿原酸（批号：MUST-0022）均购于成都曼斯特生物科技有限 公司。甲醇、乙腈、甲酸、均为色谱纯（Merck公司），水为Milli-Q Direct 16超纯水系统制备（Millipore公司）。1.3仪器1290高效液相色谱仪（美国安捷伦）；CPA225D型十万分之一分 析天平（德国Sartorius公司）；KQ-500E台式超声波清洗器（昆山市超声仪器 有限公司）；水浴锅（上海智城分析仪器制造有限公司）。2方法与结果2.1三叶青提取工艺评价指标测定2.1.1 叶总酚
5、类的含量测定 参考课题组前期建立的三叶青叶8种酚类测定 的方法4 Welch Ultimate XB-C18 色谱柱（4.6*150 mm, 2.7 口 m），以 1%o甲酸 水（A）与乙腈（B）为流动相，98%A （04 min）,98%A-90%A （415 min）， 90%A88%A （1530 min），82%A80%A （3051 min），80%A98%A （5165 min） 梯度洗脱，流速为0.4 ml/min，柱温：30C，进样量：5.0 口 L，检测波长330 nm,对照品和供试品溶液中8个成分色谱分离良好，见图1。1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.异荭草苷；5
6、.荭草苷；6.牡荆素鼠李糖苷；7.牡荆苷；8.异牡荆苷图1混合对照品（A）、提取液样品（B）色谱图2.1.2得膏率测定用移液管精密吸取25 ml抽滤后的三叶青提取液，干燥至恒重，精密称重，根据提取液体积计算得膏率。2. 1. 3紫外含量测定方法 三叶青总酚类测定，根据课题组前期建立的方法2 提取液经三乙胺法显色30 min后用紫外分光光度计于入=400 nm处测定其吸光 度A值。并以牡荆苷为对照品建立标准曲线，得牡荆苷浓度C（Ug/ml）与吸光 度 A 回归方程：A=0.06601C+0.00177，相关系数 口=0.999。2.2提取方法考察 称取三叶青叶粉末5 g,共3组（超声提取、回流提
7、取、 温浸提取），每组平行两份。按料液比（三叶青药材粉末重量：乙醇体积）1:25 加入相应倍量的95%乙醇，分别回流提取1 h,60 C温浸提取3 h,超声提取30 min,提取液趁热抽滤，测定滤液体积，依法测定得膏率和总酚类含量，结果见 表1,结果表明采用回流提取法浸膏得率最高，UV和HPLC的总酚类的含量高于 温浸提取和超声提取，因此对回流提取工艺进行进一步的优化。表1不同提取方法对三叶青总酚类的提取结果序提总浸得膏率%HPLC总酚类含UV总酚类含号取方法膏重/g量量超0.55111.32声90.6550.685回1.232流024.581.1911.510温1.123浸222.431.2
8、111.3552.3 单因素考察三叶青提取工艺2.3.1料液比的考察分别称取三叶青叶粉末5 g,按照料液比1： 10,1： 15，1：20，1：25，1：30，1：35加入95%乙醇，共6组，平行两份，回流提取 1 h,计算得膏率及总酚类含量，结果见表2。结果选定1:151:25进行正交设计 倍量的水平考察。表2 不同料液比对三叶青总酚类提取结果21：151.122.901.2141.525总序 料液号比浸膏重/g得膏率%HPLC总酚类含量%UV总酚类含量%1 1：101.023.101.1221.3951.11：2023.141.2211.5301：251：301：35581.2631.28
9、41.225.2525.6724.591.2971.2881.2861.6901.6601.625302.3.2提取时间考察 分别称取三叶青叶粉末5 g,加入25倍量95%乙醇分 别回流提取30、60、90、120、150 min,平行两份，计算得膏率及总酚类含量， 结果见表3。结果选定正交设计的时间水平为60120 min。表3 不同提取时间对三叶青总酚类提取结果总序 时间HPLC总酚类 UV总酚类浸膏重得膏率/%号 /min含量/%含量/%/g1.213024.481.21691.257451.21.2121.5752604724.933901.26425.271.2201.6114120
10、1.28625.711.2251.65451501.26725.381.2241.6282.3.3提取溶剂乙醇体积分数考察分别称取三叶青叶粉末5 g,分别加入 25倍量水，10%、30%、50%、70%、90%乙醇提取120 min，平行两份，计算得膏 率及总酚类含量,结果见表4。结果选定正交设计乙醇体积分数的水平为 50%70%。表4 不同乙醇体积分数对三叶青总酚类提取结果序体号 积分数总浸膏重/g得膏率/%HPLC总酚类含量/%UV总酚类含量/%纯11.18722.241.0011.009水10%21.13622.711.0181.001乙醇3 1.116 22.32 乙醇1.0731.0
11、7550%4 1.158 23.16 乙醇1.1201.32470%5 1.287 25.73 乙醇1.2751.69690%6 1.178 23.55 乙醇1.2151.2512.4 正交设计实验法优化三叶青提取工艺分别称取三叶青粉末5 g,设置9组，每组平行2份，通过L9(34)正交表设计实验方案，优选最佳提取工艺，计算得膏率及总酚类含量，结果见表5。表5三叶青提取工艺正交设计表A/BD/乙HP得UV序C/LC总酚提取时/提取醇体积分膏率总酚类号料液比类含量间/min次数数/%/%含量/%1(11(11(5021.1.160)(1次):15)%)2.8114221521(60)2(2 次)
12、2(1:20)2(60%)26.911.303160031(33(13(7021.160)(3 次):25)%)8.1232367242(12(13(7021.190)(1 次):20)%)4.3824464652(23(11(5021.190)(2 次):25)%)8.7028045762(31(12(6021.190)(3 次):15)%)6.4923846073(13(12(6021.1120)(1 次):25)%)5.6725160183(21(13(7021.1120)(2 次):15)%)5.4523353693(32(11(5021.1120)(3 次):20)%)8.64305475K1(25224.26.7得膏率）.944.28911K2(26226.26.3得膏率）.527.02646K3(26227.25.9得膏率）.587.75500R(得0.32.50.73膏率）639.466831K1(1.11.21.24HPLC 总酚)256.213053K2(1.11.21.26HPLC 总酚)255.272844K3(1.11.21.26HPLC 总酚)263.289857R(HP0.00.00.02008.076804K1(1.11.41.38UV总酚）496.488043K2
