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1、人类EGFF基因突变荧光 PCR检 测试剂盒说明书人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明 书【产品名称】通用名称主人类EGFR基因突变荧光PCR 测试列盘英文名称上 Shuwtn1 Human EGFR Gvnc Mutation Detection Kit fwr Rcal-l imc PC I!【包装规格】T测试/【预期用途】EGHK是一种细胞膜表血的糖蛋白受体具有酪氨酸撒酶Kinase, TK)活性，是原癌基 因c-erbB-l ()的表达产物EGFR的主要信号转导途径有丫 PI3K-PDK通路，RAS-RAF-Mfr：K-KRK-MAiJK通路，卩LOf通路，JAK-STAT通路
2、。通过这些途龟 将胞外信号转化 为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺徽，调节细胞的生长、増殖、分化，抑制细胞的凋亡* EGFR异 常调节通过多种机制促进细胞融性转化+包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体皀分泌环的括化以及 特定的磷醴酶失活，其中涉及肿瘤发生和迸展的机制中最常见的是EGI R的基因突变和过度表达EGFR基因位于了号染色棒烧臂7pl2-l4E,由渊个外显子组成其突变主要发生在EGFR酩孰般激酶的 VTP结合位点的編码区(第却外显子,研究表明，EGFR酷豹酸激酶抑制剂(例如吉非替尼、厄洛替 尼和埃可替尼等)疗效与“沁基因的突变有密切的相关性.目前已经报道大约有乳种突变与吉非替尼的
3、 药物反应相关*主要是沙外显子上的觥失突变和丄【外显子上的I跖別i的点突变。外显子1977-750也氨基 酸的大约卸种毓失约占所有突变的45%,其中以两种ddE746-A750(2235 2249(kl15和223 2250rtdi砂島为 常见.占到外显子19缺失总数的75%t外显予21LS5KRK点突变占所有突变的轻酶左右*外显子馆的3 种点突变(G719X)约占盘临*外显子2(1的突变占1%左右。另外研究陵现外显子対上的17%站突变与酪氨 醸激酶抑制剂葯物的耐药性相关“木试剤盒以肿瘤D1SA为检测样木，提供疋拧尸虚基因突变的罡性检测.木试剂您仅为临床医生肿瘤杷向 翔疗药物的选择提供參考，具
4、体临床应用时须结合实际情况进行判断不能以本试剤盒检测结果作为临床 诊斷的唯一依据。【检测廉理】本试剂盘皓合特异性引物和丁删时河探针技术，用实时黄光卩CR方法检测DIV去样品中的7*突变基 因利用特异性引物对突变靶序列进存扩增，同时阻滞野生型的扩增，通ilTaqMan探针对扩增产物谱行 检测，便得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增*从而达到高检测特异性和高灵敏度【主要组成成分】本试剂盒具休包含组分如表1表1编号组分份数体积(pL)119-Bd检测反应液1150219-DcI 2)检测反应液11503阴砧I检测反应液11504ZOJns检测反应液11505T790M检测反应液11506L8鬪R检测
5、反应液11507LS61Q检测反应液1150NG7I9X检测反应液1150外控检测反应液1)50r-Taq130阳性对照DN岛11011无菌超纯水1500【储存条件及有效期】避光，加弋以下保存，避免反良冻融(不要趙过次h有效期务个月【适用仪器】ABI 7300, ABI 7500, AR 70, ABI StepOnc, ABl StcpOnv Plus, Rwtar-Gcn Q【样本要求】亦试剂盒可以检测从新鲜组旅及FFFE组织中提取的l)XAP及啟度影响检测的特异性和灵敏度DMA的质量与样本保存时间、样本组应、DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织 细胞的偃朵程度也不同*因
6、此对样本做如下要求；K 新鲜标本的制备过程中，术后标本取下后应立即啟入-卸C以下冰箱中保存*石蜡包堤组织制备过程中， 术后标本应在I个小时内放入10坯中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块M4-20倍，固定时 间应在64我小时之间；2. 新鲜组织样本”要确探含有肿搐细胞大于1 %，尽量减少正常组织、间质及坏死组织*推荐使用商业化 试剂盒提取DNA(AXGEN( QIAGEN等公司产品提取的DN.%用分光光度计检测。再启纯度， A260/A280在1出J.D之问如果不能立即检测请置于JDU保存”乩I F PE组织样本，要确保含有肿瘤细胞.尽量去除坏死组织及石殂边缘推荐使用裔业化试剂盒提取DN
7、A(QAamp DNA FFPETUsue Kit).提取的I人用分光光度计检测0MA纯度r A26Q/A28*在1上4.0 之间，如果不能立即检测情賈于存* F1TE#1织样本慄存年限尚未超过3年.申、样本切片规格要求为土横切面面积至少fimmxGmm.厚度阳叫3片，如果切片面积小请适当增抑切 片数最终援取的1小鼻用lOUM“(KlpL水落解+分光光度计检测浓度后*稀释或诙编成5-IUns/pL“【检验方法】本试別盒可以进行5人檢的检测反应，并为每个样本顒外提供一个聲照基因扩増反应，用于估测样羸实 际DMA的浓度*建议每批拭实验都检测一个阳性对照(positive coiitml和一个无模枫
8、阴性对照(XTC),建议 棍据实验条件进疔分区操作，如样品处理区，反应液配制区等*具体操作步骤如下匸L 将试剂盒中所有组廿冰上融化涡旋混匀井短暂离心，放置于冰上-注意:试剂盒中时所有试管在 开盖前均应短祈离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。f2. 每批冥验根据待检测样本数、一个阳性对將、一个阴性对照”同时计算井分别配制1-&号反应液。每 个反应液所需反应数二特测样本数+ 2 一个阳性对瞬、-个阴性对照)+而每孑反应所需反应灌 19,7jiL+需r-T旳酶630“即从1用号反应液中分别取(19力反应数)pL于对应编号的1”5EP管*再 分别拥入5.3只反应数“山的“丁凹酶注意；电于取
9、样误豊，请根据情况适当多配置0.3个反应即可3. 将配制好的混合液轻轻充分混匀，井按照每20/iL分裝到每个反应管中。4. 然后向每个反应辔中加入测，或阳性禅照或水(试剂盒提供h待检测样本最佳浓度范 围为SiiK/gHOnft/nL,朋每个反应管中有效。忖4总量为25-5ftnft,5，箱科离心消除反应倉中的气泡将巩*反应管啟入PCR仪。样本在PCR反应板中的布局可参见表2表2建议布局#突变19-del(1)19-del(2)S768I20-InsT790ML858RL861QG719X外控1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品12样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品
10、2样品23样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品34样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品45样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品56STDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTD7NTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTC1.打开操作软件，设置PCR扩增程序为19-del(1 )19-del(2 )S768I20-InsT790ML858RL861QG719X阳CT28CT28CT3CT2CT28CT2CT2CT28CT28CT3CT 2CT28CT2CT 2CT纹8性0889Stagel： 95 C 5minStage2: 9
11、5 C 20s, 57C 32s , 5个循环Stage3: 95 C 20s, 60C 32s , 40个循环 收集 FAM 信号注：如果使用 ABI定量PCR仪，将 “Passive Referenced置为“None ,“reporte设置为“FAM ,“quencher设置为 “TAMRA【参考值】检测结果判定：1. 当样品CT值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。2. 当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。表3结果判定【实验结果的解释】1. 阈值设定：针对 ABI7500机型，对以上9种检测分别设定阈值，其中 19-del(1) ,19-del(2
12、)和G719X阈值 设定为12000,其他为300002. 阴性无模板空白对照(NTC)应无扩增曲线升起；否则表明此次实验结果无效，建议更换操作环境或反应试剂，重新试验。(若只稍稍升起，但对结果判断无显著影响，则结果依然有效)3. 阳性对照Ct值一般小于25，参照基因体系的阳性对照 CT值一般小于23，但须根据仪器型号等情况进 行判断。4. CT值确定：建议对于一个突变检测体系应同时选择参照基因反应管，STD反应管，NTC和样品反应管，一并划定阈值，从而得到外控 CT值和样品的突变CT值。5. 参照基因CT值应控制在23之前，以用于评估反应体系中的 DNA模板量。若外控CT值大于23,说明加入
13、的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少，需重新提取或增大 DNA加入量再做。（仅对全阴性结果 而言；若已经判断为阳性，结果仍然可靠）附表:突变外显子碱基变化Cosmic ID对应检测体系E746_A750del(1)192235-2249 del 1562231号反应体系E746_A750del(2)192236-2250 del 15622519-Del( 1)L747_P753S192240-2257 del 佃12370E746 T751I192235-2252AAT del 1813551E746 T751A192237-2251 del 1512678E746_S752D1922
14、38-2255 del 佃6220L747 A750P192238-2248GC del 1112422L747 T751Q192238-2252GCA del 1512419L747_E749del192239-2247 del 96218L747 T751del192239-2253 del 156254L747 S752del192239-2256 del 佃6255L747 A750P192239-2248C del 1012382L747_P753Q192239-2258CA del 2012387L747_T751S192240-2251 del 126210L747_T751del192240-2254 del 1512369L747_T751P192239-2251
