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1、适配体的筛选技术SELEX摘要适配体泛指具有抗体功能的单股寡核苷酸(RNA或DNA)，其可形成的特殊的立 体结构如以辨识特定的蛋白质。在一定环境下，单链DNA或RNA能与某些物质形成多种热力 学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。在大多数情况下，溶液中的单链DNA或RNA 的空间构象是不确定的, 当有目标分子存在时, 在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠, 形成发夹(hairpin)、假结(pseudokno t )、凸环(bulg e)、G-四分体(G-quar tet )等特殊结 构, 通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合。这种结合不需要依靠通常 的核糖磷酸骨架的亲和力
2、, 而且靶物质既可以是蛋白质, 也可以是多肽及小分子物质。这种 寡核苷酸片段被称为适配体。适配体的产生是借由一种指数富集配体的系统进化技术 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。SELEX是20世纪90年代 发展起来的一项组合化学技术。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选到特异性 与靶物质高度亲和的核酸配体( ap tamer) , 其解离常数可以与单克隆抗体媲美。经过十几 年的发展,SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具，被广泛应用到分子生物学、 基因组学、临床医学等众多研究领域，并且
3、衍生出了混合靶SELEX、体内SELEX、基因 组SELEX等各种子技术。随着基因组学和蛋白质组学的深入开展,SELEX技术会有更广 泛的应用前景。关键词 适配体；指数富集配体的系统进化;配体;Aptamer screening technology 一 SELEXAbstract Aptamers function refers to a single-stranded antibodyoligonucleotides (RNA or DNA), which can form three-dimensional structures such as special to identify s
4、pecific proteins. In certain circumstances, a single-stranded DNA or RNA can form a variety of substances with certain thermodynamically stable three-dimensional structure for a variety of functional molecules. In most cases, the solution of the single-stranded DNA or RNA conformational is uncertain
5、, when the presence of target molecules in a suitable environment occurs adaptive single-stranded oligo folded forms a hairpin (hairpin) , fake knot (pseudokno t), convex ring (bulg e), G-tetrad (G-quartet)andotherspecialstructure,throughhydrogenbonding,hydrophobic stacking interactions, van der Waa
6、ls and other closely integrated with the target molecule. This combination does not need to rely on the usual affinity ribose phosphate backbone and the target substance may be a protein, polypeptide can also be small molecules. This oligonucleotide is called aptamers. Aptamer is produced by means o
7、f ligands by exponential enrichment caused by a phylogenetic techniques (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX). SELEX was in the 1990s developed a combinatorial chemistry techniques. This technology can be single-stranded nucleic acid sequence from a random library wasscr
8、eenedwiththetargetsubstancetoaspecifichighaffinitynucleicacid ligands (ap tamer), dissociation constant of the monoclonal antibody can be comparable. After ten years of development, SELEX technology has become an important research tool, and tools are widely applied to molecular biology, genomics, c
9、linical research and many other fields, and derived from a mixed target SELEX, in vivo SELEX, genome SELEX various sub-technologies. With genomics and proteomics in depth, SELEX technology has wider applications. key words Aptamer,SELEX,ligand20世纪90年代初，美国科罗拉多大学(University of Col2 orado)的Tuerk和Gold 将
10、翻译T4 DNA聚合酶(gp43)的mRNA中一含有8个碱基的环状结构进行序列随机化(该 区域为茎环结构，含18个碱基，其中环的部分有8个碱基,gp43本身可以结合该区域 并对自身合成进行调节)， 得到一个含65 536种序列的核酸库， 经过几轮筛选从中得到 了两种与gp43紧密结合的核酸配体：一种为已知的野生型，另一种变体与野生型相差4 个碱基，两者的解离常数接近(野生型Kd = 5 X10 - 9 mol/L,变异性Kd = 3. 2 X10 -7 mol/L )。John Abelson曾猜测变体可能在生物进化的过程中出现过，但由于经受 不住选择压力的考验， 最终无法保留下来。鉴于该技术
11、是基于进化过程的机制变异、选 择、复制， 因此被命名为“指数富集配体的系统进化”( systematic evolution of ligandsby exponential enrichment， SELEX) 。1、SELEX技术的原理及步骤1.1基本原理利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机寡核苷酸文 库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基(aptamer)，经反复扩增、筛选数个循 环，即可使与该靶随机序列长度在20100个碱基左右。将分子特异结合的寡核苷酸序 列得到富集.5PartitionBiiridfing to targe-lSELEXAmpl i f
12、i eacioin ro UFldPurified prole in Con 31 ant regionRandom sequence (n=20-100)Cisnstant re gianClonlHg nd SequencingSELEX过程中，首先是用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库，库中的 每一个成员是一个线形的寡聚物，库中分子多样性的程度取决于随机寡核苷酸的长度。 理论上讲，一个40个碱基的随机序列可有1.2 X 1024种核苷酸排列顺序(440=1.2 X 1024)。实际上lumol的固相DNA合成的随机组合核苷酸库的序列多样性仅限制于1014 1015种，能否找出与
13、靶分子相互作用的稀有序列，很大程度上取决于组合库的多样性， 在所有种类的组合随机序列库中寡核苷酸库的多样性最为丰富。筛选过程中，首先在一定的温度下将寡核苷酸随机序列库与靶分子共同孵育于特定的 缓冲液中，组合库中的极少数分子将与靶分子结合，然后用物理的方法将结合的分子与 未结合的分子分离开来。标准的方法是将蛋白靶分子固定于硝酸纤维素滤膜上，而其他 小的靶分子则固定于固相载体的表面，因此，未与靶分子结合的序列很容易被冲洗掉， 而与靶分子结合的序列将被分离出来并放大以获得一个序列库，再对这一序列库进行下 一轮的筛选和放大。每一轮选择的严格性决定了高亲和结合子的增强效率。高亲和结合 的增强进度可通过与
14、靶分子的结合分析来确定。经过数轮的筛选和放大后，一旦达到亲 和饱和，所得到的增强库即被克隆和测序，以获得筛选库中每一个序列的信息。单个序 列的特异性将根据其与靶分子结合的能力做进一步的定性。通常情况下，大多数序列 (90%以上)与靶分子有很好的高选择性亲和力。通过SELEX筛选出来的Aptamer是含有 一段固定序列的全长序列，这个固定序列主要用于协助放大过程，在放大过程中起到引 物的作用。这种全长Aptamer 般由7080个碱基构成，通过剪切可去除那些对结合 靶分予无关紧要的片段，或折叠成最利于结合靶分子的结构。剪切Aptamer主要是用于 确定最小的靶分子结合域，目前已得到数种少于40个
15、核苷酸的功能性Aptamer。在大多 数情况下，Aptamer的固定片段主要用于放大，而对Aptamer的功能(即识别功能)无关 紧要，因此可以去除该段的固定片段。现已发现了一种无须固定引物序列的SELEX方法， 从而筛选出较短的Aptamer。SELEX技术之所以能够建立，是由于形成寡核苷酸的碱基之间的相互作用往往形成许 多空间结构，如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)或凸环(bulge)等，这些结构非常容 易与各类靶分子结合。一个足够容量的寡核苷酸库包容了所有可能的立体结构，在与靶 分子结合时，几乎不需要失去墒就能存在一个适配的结构，因此有可能从中筛到任何 种类的靶分子的
16、高亲和力配基。1.2步骤(1) 通过人工合成，建立dsDNA随机序列库，库容量通常在10141015之间，每条 序列由两端的恒定区和中间的随机区组成，随机区的序列长度一般在3040 nt之间， 恒定区为PCR扩增所必须。若使用RNA文库，则需在一端的恒定区加入噬菌体T7启动子， 可使DNA文库转化成RNA文库。(2)与靶物质反应，筛选出相互结合的靶物质2核酸复合体。 筛选技术包括硝酸纤维膜过滤结合( nitro2cellulose filter binding) ，亲和层析 (affini ty chroma to graphy)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(elec tro2 phoresis on native polyacrylamide gels)、按相对分子质量(M r )分级过柱(size fractionation on columns)等等。(3)将筛选到的蛋白2核酸复合物分离，得到的核酸进行PCR扩增，变性 成单链以准备进行下一轮
