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1、烟草总RNA提取（QIAGEN试剂盒提取）一、实验前方法及试剂的选择 1.提取RNA 的目的决定方法影响提取的成本及效率 RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，既增加成本又降低效率。 2.样品的收集/保存影响降解的因素 样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，
2、只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。 3.样品的破碎及匀浆影响降解和得率的因素 样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝
3、脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。 4.裂解液的选择影响操作方便程度，内源杂质残留的因素 常用的裂解液几乎都能抑制Rnase活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。 5.纯化方法的选择影响内源杂质残留，抽提速度的因素 对于干净的样品，如细胞，手边的
4、几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。二、提取前准备工作1.DEPC处理水的配制DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，DEPC气
5、味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作，不小心占到手上注意立即冲洗。RNase AwayTM试剂可以替代DEPC，操作简单，价格低，且无毒性。只需将RNase AwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水冲洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不会残留而干扰后继实验。 (1) 配制DEPC水溶液(用来浸泡枪头、离心管等)：1000mL灭菌去离子水中加入1mL DEPC，盖紧塞子振摇5min，静置4小时，倒入盛有枪头和离心管的容器内，用保鲜膜封住容器口以防止DEPC挥发，室温静置过夜，倒掉溶液，处理物品灭菌30min以除去残留的DEPC。 倒出的DEPC水溶液高压灭菌
6、30min再丢弃。枪头、离心管等的处理也可使用高压灭菌至少两次来实现（见下2）(2) 配制 DEPC处理水（用来配RNA电泳用缓冲液）：1000mL去离子水中加入1mL DEPC，盖紧塞子振摇，静置过夜，再加上塑料袋封紧瓶口，高压灭菌30min以除去残留的DEPC。(3)配1000ml的DEPC处理水，加1ml DEPC。在磁力搅拌器上搅拌处理（12 h）至完全溶解，即看不到“油珠”为止，然后高压蒸汽灭菌DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。使用时最好分装小瓶，尽量避免污染。2.研钵、试剂瓶、枪头、离心管及药匙等用具的处理研钵、试剂瓶及药匙洗净后，用锡箔纸包好后在烘箱中200烘烤至少4
7、h。枪头、离心管等塑料制品于高压蒸汽灭菌锅中121，40 min灭菌至少两次，灭菌完成后取出在烘箱中70烘干备用。三、提取方法1.1 RNA提取（RNeasy Plant Mini Kit提取）原理：在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取缓冲液中裂解植物组织粉末。在提取缓冲液中包含RNase酶抑制剂，抑制RNase活性并确保RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片阻留在柱上，溶液被均质化，包括RNA在内的小分子物质通过离心柱，加入乙醇后，再经过第二个离心柱，RNA就结合在底部有硅胶的膜上，洗去其他杂质，最后用无RNase水溶出RNA，该柱子最大可结合100 g大于200 bp的RNA，小分子RNA
8、如5.8S、5S、tRNA将会丢失。每个柱子所用起始材料最多为100 mg，可分离3070 g的总RNA。由于不同发育阶段和不同组织所含RNA不同，可以调整起始材料用量，如果组织含有RNA较少，可用100 mg，若RNA含量较高，则起始材料应小于100 mg。即使总RNA含量未达到柱子吸附最大值，起始材料太多时，由于裂解不彻底，同样导致RNA产量和纯度降低。如果总RNA含量超过100 g，柱子也只能回收100 g以下的RNA。对于胚乳等一类组织，则应用RLC提取液，其流程如下：植物组织（100 mg）研磨，提取缓冲液RLT或RLC裂解离心过柱（淡紫色柱）加入乙醇离心过柱（粉红色柱），RNA结合
9、在膜上用缓冲液RW1、RPE洗涤用Rnase-free水溶解洗脱出RNA总RNA。 提取出总RNA后，要对其质量和浓度进行测定。组成RNA碱基在紫外光谱区都有一定的吸收值，最大吸收波长为250270 nm。碱基与磷酸或糖形成核苷酸后，其最大吸收波长为260 nm，吸收波谷为230 nm，这就是分光光度计测定其浓度的原理。因此根据RNA溶液在260 nm下的OD值就可计算出样品浓度，1 OD值相当于40g/ml，其计算分式是：RNA样品浓度（g/ml）= OD26040稀释倍数。 由于蛋白质在280 nm下有吸收高峰，用OD260/ OD280比值就可计算出样品纯度。分光光度计可测定其浓度和纯度
10、，但不能得到完整性的信息，因此要用琼脂糖凝胶电泳来检查其是否完整。如前所述，总RNA中含有28S、18S、5S等rRNA，其中28S、18S最丰富，所占比例基本不变，在琼脂糖凝胶电泳上28S rRNA亮度约为18S rRNA亮度的1倍，这样的结果说明完整性较好。如果亮度相同，说明已有不同程度的降解。严重降解的样品，就见不到28S rRNA的带，甚至18S的带也见不到，呈现一片。mRNA在琼脂糖胶上按相对分子质量由大到小连续分布，无明显条带出现。RNA电泳可在变性和非变性胶上进行，胶的浓度应为1.01.5%，在非变性胶上无法判断RNA的相对分子质量，因为RNA迁移率与相对分子质量相关性比较差。
11、提取RNA的详细步骤如下：1称取新鲜叶组织样品100 mg，液氮速冻。2在预冷的研钵中研磨成细粉（研磨一定要充分彻底），连液氮一起转移到2 ml预冷的离心管中。3待液氮挥发（但不能解冻）后，加入450 ul提取缓冲液RLT buffer，涡旋混匀，并在56温浴13 min。注： RLT buffer临用前最好加入1/100体积的14.3 M -巯基乙醇，加后保存时间不超过1个月，RLT溶液应在1个月内使用。4将裂解液加到QIAshredder spin column离心柱（淡紫色柱）上，下接一个2 ml收集管，14000 rpm离心2 min。（如果将裂解液粘稠，可切去吸头顶端，用大口吸头吸取
12、）。裂解液通过柱子时被均质化，大部分组织碎片都被截留在柱子表面，只有少部分通过柱子形成沉淀。因此，应小心吸取上清液，转移到另一新离心管，不要吸细胞碎片残渣沉淀。随后的步骤中仅使用上清液。5加入0.5倍体积96100%乙醇，立即用枪头轻轻吹打混合均匀。如果裂解液有损失（可能会少于450 L），则相应减少乙醇用量。加入乙醇后，可能会出现沉淀，但对提取无影响。6将混合液全部（包括沉淀，一般为675 L）转移到吸附RNA的RNeasy spin column离心柱（粉红色柱），下接一个2 ml collection tube（收集管），大于8000 g或10000 rpm，离心15 s。如果混合液体积
13、超过700 L，每次只加700 L到离心柱上，按上述条件离心。每次离心后弃去管内液体，步骤7中重复使用collection tube（收集管）。注：滤液中含有buffer RLT（或buffer RLC），及buffer RW1，其不能与漂白剂共存。 若要在离心柱中加入Dnase 消化，参照附录中的相关操作。7加入700 L buffer RW1，大于8000 xg (或10000 rpm)离心25 s，弃去滤液，步骤8中重复使用collection tube（收集管）。注：离心后，小心将RNeasy spin column从collection tube移开，避免RNeasy spin co
14、lumn接触到滤液。 如果要在离心柱中加入Dnase 消化，此步骤可跳过（省略）。8向RNeasy spin column中加入500 L buffer RPE，大于8000 xg（或10000 rpm）离心15 s。弃去管内滤液，步骤9中重复使用collection tube（收集管）。注：试剂盒提供浓缩的buffer RPE，使用前务必确保已加入4倍体积的96100%乙醇，成为工作液。9加入500 L buffer RPE到RNeasy spin column上，最大转速14000 rpm离心2 min，干燥离心柱，弃去收集管。注：残留乙醇会干扰随后的反应，此次离心要保证无乙醇残留。若有乙
15、醇残留，以最大转速延长离心时间。小心移去RNeasy spin column，不要接触到collection tube中的液体，以防止携带乙醇。10把离心柱连接到一新的1.5 ml收集管上，加入2030 L 无RNase水，大于8000 g或10000 r/min离心1 min，洗脱RNA。若RNA产量在20 g以上，用3050 L无RNase水再洗脱一次。RNA样品存于20或80冰箱。1.2 RNA质量评价1微量分光光度计对RNA定量：开启微量分光光度计，预热30 min。用DEPC处理水校正零点。用DEPC处理水稀释RNA样品10倍后，读取相应数值，计算出所提取RNA的含量。注：OD260 /OD280 2.1 说明有部分降解。2琼脂糖凝胶甲醛变性电泳制备琼脂糖凝胶（1.0%）。称取0.25 g琼脂糖，加18 ml DEPC处理的水，加热溶化。冷却至60，在通风橱内加入10TAE 2.5 ml，甲醛（37%）4.5 ml，混匀后倒胶；制备样品。在离心管中，将RNA样品与6变性上样缓冲液按4:1比例混匀。65温浴510 min，迅速在冰上冷却5 min，瞬时离心数秒；染色：将制备好的样品与染液按10:1的比例混匀，于冰上染色101
