微生物实验汇编

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1、生物大实验三微生物学部分实验目录实验一、培养基的配制和灭菌实验二、微生物的分离、接种及培养法实验三、水中细菌总数和大肠菌群的检测实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术实验五、抗微生物药物敏感性试验实验六、微生物的生理生化反应实验七、微生物菌种保藏实验八、沉淀反应实验九、细菌鞭毛染色及其运动的观察实验十、细菌芽孢、荚膜的染色及观察实验一、培养基的配制和灭菌一、实验目的1 .了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2 .学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法。3 .进一步熟练掌握手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。二、实验器材1 .药品及试剂：可溶性淀粉，葡萄糖，KNO3,K

2、2HPO4 3H2O,MgSO4 7H2O,FeS。7H2O,K2HPO4, 1mol/L NaOH,琼脂，牛肉膏，蛋白陈，NaCl,马铃薯2 .仪器及其它试管、 三角瓶、 烧杯、 量筒、 玻棒、 天平、 药匙、 高压蒸汽灭菌锅、 pH 试纸 (5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管( 1ml ) 、玻璃珠、 PH 试纸三、实验内容1 .分组配制高氏一号培养基300ml。配方：可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4 3H2O 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼月旨 15-25g

3、水 1000ml pH 7.4-7.62 .配制牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 水 1000ml PH 7.4-7.63 .配制马丁氏培养基配方：K2HPO4 1g, MgS04 7H2O 0.5g,蛋白陈 5g,葡萄糖 l0g,琼月旨 15 20g,水 1000mL, 自然 pH 。配制方法配制20%马铃薯浸汁 取去皮马铃薯200g,切成小块，加水1000ml。80 c浸泡 1h,用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100Pa灭菌20min。即成20%马铃 薯浸汁，贮存备用。配制时，按每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热

4、融化并补足失水。4 .每组制备玻璃珠无菌水（45ml）三角瓶2个。5 .每组制备无菌水试管（4.5ml/管）10支。6 .每组包9cm培养皿24套，6套为一包。7 .每组包1ml 吸管 5 支，玻璃刮铲4 个。四、方法步骤（一）培养基的制备与分装1 .称量 按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。2 .熔化在沸水浴锅中加热熔化。3 .调 pH 用 1mol/L NaOH 调 pH 至 7.4-7.6。4 .过滤趁热用多层纱布过滤（本实验勿需过滤）5 .分装 将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。

5、 液体分装装量不超过试管的1/4， 固体分装装量不超过试管的 1/5， 分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。6 .加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸， 贴上标签， 注明培养基名称、 日期、组别。（二）无菌水的制备7 .用量筒量取45ml 水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。8 .用 5ml 吸管取 4.5ml 水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。（三）器皿的准备9 .培养皿的包装每 6 套一包，用旧报

6、纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严） 。10 .吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。11 .玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。（四）培养基、无菌水、器皿的灭菌 养基、 无菌水、器皿的灭菌12 .将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，1.05kg/cm2 压力，121.3,20min湿热灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。13 .灭菌完毕，将试管培养基冷至50左右，将试管棉塞搁在玻棒（或木棍）上，搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。14 .将灭菌的培养基放入37c的温室中培养2448h,以检查灭菌是否彻底。15 .器皿放入干热灭菌箱

7、内，加热灭菌。五、思考题1 .培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？2 .加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？3 .干热灭菌应该注意哪些事项？4 .管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？为什么？六、实验报告实验二、微生物的分离、接种及培养法一、目的要求1 .掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。2 .熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离方法

8、有： 1）平板划线分离法；2）稀释平板分离法。在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量； 在食品卫生管理方面， 需要进行微生物检测， 必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。土壤是微生物生活的大本营， 它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。 因此土壤是微生物多样性的重要场所， 可以从中分离、 纯化得到许多有价值的菌株。微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作。三、实验材料1 .菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。2 .培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、

9、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板） 。3 .土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。四、实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1 .平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到 分离的目的。具体方法如下：倒制平板-制备含菌样品稀释液-划线-倒置适温培养-观察记录1）倒制平板：将固体培养基熔化-冷却至50-55Cf注入培养皿内15ml （无菌操作）-旋匀-静置凝固-即成平板-在皿盖边贴标。2）含菌样液制备：样品少许（1-10g） ，加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等） ，可省去这操作。3）划

10、线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破） 。然后将培养皿倒置放入恒温培养箱 37，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录微生物平板划线分离平板划线分高法2 .稀释平板分离法：采用稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注 入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处 而形成菌落，可作为一种计数方法。1）制备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品 10g,加入装有90ml 无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成 10-1 土壤稀 释液，然

11、后在酒精灯火焰旁，用无 菌移液管吸取1ml10-1的稀释液注入9ml无菌 水的试管内，制成10-2的稀释液。用同样方法再制成103, 104, 105, 10-6的稀 释液。稀释完毕后，可用原来的移7管，从菌液浓度最小的 106的稀释液开始吸取1ml 的10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取 1ml 的10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内。注意：每稀释一个浓度，必须更换一支无菌吸管。用稀释平板计数时，待测 菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高， 反之则低。测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-

12、5、10-6稀释度，测定放线菌数量 时，采用10-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10 -4稀释 度。样液的确料固体培养基分离纯培养2）平板的制作：将固体培养基融化，待冷却至45-50C左右，分别倾入已盛有10-4、 105、10-6稀释液的无菌培养皿内，轻轻摇匀，静置凝固。凝固后将平板倒置于 37。叵温箱中，培养24-48小时，细菌即在所固定的位置长成肉眼能见的菌落。（二）微生物的接种方法将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。常用的接种方法如下：1 .斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。左手持菌种管和斜

13、面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动， 再拿接种环，灭菌后，接种。此法用于好气性微生物的接种。2 .液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。在将接种环送入液体培养基中时，使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。3 .穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内， （不要刺到底部） ，再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4 .平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种， 活菌计数以及在平板上进

14、行各种试验时采用的一种接种方法， 可分为下面几种：1）斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4 点）即可。2）平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。 注意事项 不同种类的微生物，其培养温度、培养时间有所不同。五、实验报告1观察划线分离的菌落形态。2采用菌落计数法，计算出所检土壤样品的细菌总数（活菌数）。3稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50左右，才倒入装有菌液的培养皿内？实验三、水中细菌总数和大肠菌群的检测（一）实验目的（1）了解和学习水中细菌总

15、数和大肠菌群的测定原理和测定意义。（2）学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。（3）学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。（二）实验原理水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物 （如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。 水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。水的微生物学的检验， 特别是肠道细菌的检验， 在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3 个，细菌总数每ml 不超过 100 个。所谓细菌总数是指1ml或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平 板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落（colony-forming unit, cfu）数，故其单 位应是 cfu/g（ml） 。它反映的是检样中活菌的数量。所谓大肠菌群， 是指在 37 24h 内能发酵乳糖产酸、