重组人胰岛素的工业制备

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1、重组人工胰岛素制备工艺的研究及其进展徐邢宾河 北 科 技 师 范 学 院 生 命 科 技 学 院 生 物 技 术 专 业 0902 班指导老师：张帆摘要: 据 WHO 统计 ，全 世界 糖尿 病患者已接近 1.2 亿，而 我国 目前 糖尿 病 患者 的总数已达 到 3000 万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。 如今我国经济发展迅速， 同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用 胰岛素治疗。胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的 刺激而分泌的一种蛋白质激素。而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物

2、胰岛素（从猪和牛 的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有 1个氨基酸不同，牛胰岛素中 有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。 2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30 位丙氨酸，置换成与 人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。 3、 重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得 的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。可 见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。 所以针对重组人工胰岛素的制备 做了以下研究。关键词：重组人工胰岛素；大肠杆菌；（His）6 一 Arg Arg 一人胰岛素原；在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万

3、安特以及我们国内的通化东宝、深圳科 兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工 胰岛素的制备方法。这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是 最有效最安全的制备胰岛素的方法。它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物， 也是造福人类的新一代药物生产方法。不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治 疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程， 发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们 必须要了解和学习得。1 重组 人工 胰岛 素的 生

4、产 原理通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hl。酵母系统下游后加工比细菌 表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少（150 mg / L）, 产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达 系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E. CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用 E. coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下 游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提 高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的 高效完整的基因工程E.

5、 coli发酵表达（His）6 Arg Arg 一人胰岛素原（His）6 Arg Arg human proinsulin ， PPh PI，后 加工成 hl 的制备 工艺。2 重组 人工 胰岛 素的 生产 工艺 流程2.1 菌 种 的 制 备2.1.1 目 的 基 因 的 提 取既从人的 DNA 中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原 DNA 中 分 离 。 主 要 有 如 下 4 种 方 法 ：（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要 的。 至于如何筛选， 用 DNA 分子杂交， 即 DNA 探针（2）人工合成法：根据转录蛋白或者 mRNA 推导出

6、基因序列，然后人工合成 没有内含子。（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用（4）PCR 扩增技术：用于大量生产该段基因片段， 用于商业化运作。2.1.2 提 取 质 粒使用细胞工程,培养大肠杆菌， 从大肠杆菌的细胞质中提取质粒 质粒为环状。碱裂解法：此方法适用于小量质粒 DNA 的提取，提取的质粒 DNA 可直 接 用 于 酶 切 、 PCR 扩 增、 银 染 序 列分 析 。2.1.3 基 因 重 组 将取出目的基因与质粒， 先利用同种限制性内切酶将质粒切开， 再使用 DNA 连接 酶将目的基因与质粒“缝合”， 形成一个能表达出胰岛素的 DNA 质粒。2.1.4 将质粒送回大

7、肠 杆菌再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因， 此时将重组的质粒也放入培养液中， 大肠杆菌便会将重组质粒吸收。将大肠杆菌用氯化钙处理， 以增大大肠杆菌细胞壁的通透性， 使含有目的基因的 重组质粒能够进入受体细胞， 此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞， 使其处于 最适摄取和容纳外来 DNA 的生理状态）。2.2 胰岛素的产生和精 制（即菌种的发酵培养） 重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工技术在如今已经是炉火纯青。有近百年 的发酵工程为基础， 结合现在的基因工程技术的产物， 在菌种制备后的发酵培养过程 更 是 可 靠 和 安 全 的 。发酵培养流程见

8、下图表：对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期 时转入发酵罐培养分两阶段进行控制，第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌 体达到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表 达目的产物，HPLC检测目的产物含量目的产物存在于发酵液上清中，此步骤主要控制目的产物收率通过两步柱层析，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白 利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇调节PH值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体固体控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1,4-丁二醇再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇调节PH值，使P2沉淀

9、，再经离心干燥，得中间体I固体通过控制湿度与温度进行脱帽反应，得到终产物胰岛素主要试剂为丙酮，产品为半固体经过两步柱层析对胰岛素进行提纯，试剂为ris-HCl和异丙醇通过超滤对提纯后的胰岛素进行浓缩，通过管道传递到下工序通过制备色谱对胰岛素粗品进行精制，主要试剂为色谱乙腈然后经两步结晶后通过管道过滤除菌到百级区对胰岛素成品进行一次结晶和水洗对水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛素成品制得的胰岛素经过深加工，可以得到片剂，注射剂和肺部吸入制剂等。3 药物 检测这种重组人工胰岛素的检测重点应该是 测 定 生 物 活 性 效 价 测 定 控 制 产 品 中 杂 质 潜 在 有 害 物 质 保

10、证 产 品 安 全 性 和 有 效 性胰岛素的生物效应包括许多方面 , 它是体内唯一能降低血糖的激素。也是唯一 时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。胰岛素的主要靶器官为肝脏、肌肉及脂肪组 织 , 它控 制 着三大 营养物 质糖、 蛋 白 质、 脂 肪的 代谢 和贮存 。最 明显的 作用 是影 响 糖的代 谢, 降低 血糖 ,即 促进肝 脏及 肌肉组织中 葡萄糖的利 用 , 激活糖 原合成 酶和 丙酮 酸脱氢酶等的活性, 促 进糖原的合成 并抑制糖原的分解 。此外, 对肝 脏来说还有抑制 蛋白质分解的作用；在肌肉组织中促进+K从细胞外向细胞内的转运;在脂肪组织中促进 氨基酸由细胞外向细胞内转运,

11、促进脂肪的合成,抑制脂肪的分解等作用。这些在细胞 水平上对代谢系统的作用是基于胰岛素与其受体的结合得以实现的。关于效价的测定中华人民共和国药典指出供试品制成盐酸溶液，进入高效液 相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长214nm处检测重组人胰岛素的吸 收值， 计算出其含量。无数临床试验证明， 到目前为止， 重组人工胰岛素是稳定糖尿病最好的选择， 其 没有潜在的危险， 并且安全可靠。4 问题 与展 望胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位， 但因注射给药让许多患者产 生畏惧心理， 使其作用发挥受到限制。为了减少不便和疼痛， 医药界正在全力以赴投入研究， 开发更新的胰岛素剂型及 给药方

12、式。目前有关新式胰岛素产品的研究方向， 可归纳为 3类:1. 新的给药方式， 例如:口服、吸入;2. 改变药物代谢机制;3. 改进注射手段， 让使用者无痛; 这是国际国内胰岛素类药物研究发展的前沿和趋势。4.1 非 注 射 型 胰 岛 素让胰岛素和其他药物一样成为非注射型药品， 通过口服、鼻吸等途径进入人体而 免除注射， 需要研究解决制剂吸收的问题。由于胰岛素本身的疗效和安全性已经非常 确定， 而改变的是给药途径， 因此吸收程度和速度是需要解决的首要问题。4.2 口 服 胰 岛 素 胰岛素本身为蛋白质，口服后会被胃肠道降解破坏，所以常规胰岛素不能口服。口服给药受到胃酸、蛋白分解酶、大分子吸收、

13、肝脏首过效应等影响，因此，口服胰 岛素的研究方向主要在以下几方面:1. 选用惰性材料如高分子纤维素，制成了微小包裹球。这种小球在胃中不溶，保 护胰岛素不被破坏。现阶段的研究成果可保持其生物有效性达到皮下注射给药的一半2. 加入酶抑制剂，将蛋白酶抑制剂与胰岛素一起包裹在小球中，可有助于提高胰 岛素的吸收。3. 加入吸收促进剂，将胰岛素与吸收促进剂同时给药，能进一步促进口服胰岛素 吸收，其中的螯合剂能与肠粘膜上活性离子结合，造成膜通道通透性增加而促进药物 在肠道吸收。国内外有关口服胰岛素研究报道虽然很多，但至今未见到实际应用于临床。其主 要原因是口服生物利用度低、制剂的稳定性、质量标准等问题尚未解

14、决。口服胰岛素 的成功与否在于如何解决其在胃肠道的活性和稳定性，一旦成功将是胰岛素研究的重 大突破。4.3 经 肺 吸 入 胰 岛 素 胰岛素经肺吸入给药，是替代注射最有希望的途径之一。 肺部特殊的生理构造是具有极大的肺泡表面积。此点优势具有决定性，使胰岛素 这样的大分子药物吸收成为可能;药物可迅速到达;不必经过肝脏首过效应;提高了药物 的生物利用度。另外重要的一点，胰岛素在肺部吸收的速度快，符合内源性胰岛素的 释放特征和人体的需要，并且可以在进餐的同时应用，而使用药更加方便。最新的进展是采用干粉剂型，其优于早先的液体气雾剂。干粉的稳定性好，保质 期可达两年;干粉的载药量高，仅需吸13次即可满

15、足剂量要求，而如果用喷雾则需 深吸几十次。胰岛素吸入制剂在国外已进入第二、三期临床试验， 一些制药公司的专家相信在 不久的将来就会投入使用。此项技术已经引起了广泛的关注， 但其面临尚待解决的问 题是:药物吸收的稳定性、成本高以及对肺功能的影响等，通过临床试验和上市的时间 尚属未知。吸入胰岛素相对于传统的注射方式的优越性不言而喻， 且理论上颇具可行性， 我 们 的 医 生 和 患 者 都 在 热 切 盼 望 中 。4.4 其 他 非 注 射 给 药 方 式 正在研究中的其他非注射胰岛素给药途径包括:口腔喷雾、鼻腔给药、直肠栓剂给 药、滴眼剂、透皮或口腔粘膜给药。这些非注射给药途径都有一些难以克服

16、的问题， 如吸收缓慢、药峰浓度低、生物 利用度低等， 均不能达到注射剂的效果， 目前尚无法适合糖尿病临床治疗的需要。胰岛素非注射给药是医药界的重大和热门研究课题，其结果对糖尿病治疗产生深 远影响。国内外的专家学者正致力于相关的研究开发。参考文献:1 李晓红，朱慧玲，余荣，李红霞重组人工胰岛素制备工艺M.四川大学学报，2007,39卷第4 期.2 王琼庆，冯佑民胰岛素蛋白质研究进展生物化学与生物物理进展，1996,23(5):402.3 张晓刚， 李志华.发酵工程制药。北京工业出版社,20044 陈 来 同 , 孙 宇 .B19-Gly-B20 人 胰 岛 素 的 分 离 纯 化 及 性 质 研