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1、地高辛标记与检测DNA试剂盒DIG DNA Labeling and Detection Kit采用地高辛-dUTP进行随机引物 DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。此试剂盒可对10ng-3“gDNA进行25次标记反应，可检测10x10cm2面积的杂交膜50张指导手册1前言1.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分2介绍2.1产品简介3操作步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA3.4标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定3.6杂交3.7免疫检测3.8 DNA印记的洗脱和再杂交1.2试剂盒的成分瓶号标记内容 包括功能1无标记对照DNA1
2、2无标记对照DNA23DNA稀释缓冲液2 管 1mL50pg/mL 鱼 精 DNA,10mM Tris-HCl,1mMEDTA, pH8.0 在 25C澄清溶液4DIG标记的对照DNA20吐5yg/mL 质粒 pBR328 DNA （用 Bam HI 线性 化）澄清溶液用于确定标记效率5六聚核苷酸混合物6标记用混合物7DNA聚合酶1大片 段标记级8抗地咼辛的碱性磷 酸酶结合物200吐750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液9NBT/BCIP10封阻试剂附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作
3、程序的前面提供了详细的信息。操作程序仪器设备试剂3.3 DIG-DNA 标记水浴灭菌的双蒸水0.2M pH8.0灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲 组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5 DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用 于紫外交联的其他设备2xSSC或者lOxSSC3.6杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料 袋或者滚筒瓶（分子杂交 炉）注意：当用地高辛杂交缓冲 液工作时，不要用开口的托 盘。DIG Easy Hyb（杂交缓冲液，需单独 购买）3.7免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋*地高辛洗涤和封阻缓冲 组合* T
4、E缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.8 DNA斑点的脱色和大的托盘DMF重新标记探针水浴0.2M NaOH，0.1%SDS2xSSC*标记的产品可以从Roche Applied Science获得。2介绍2.1产品概况实验原则此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA 探针用于杂交和后续的免疫检测。步骤描述DNA标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛 标记的DNA探针。地冋辛标记的冋效引物疋 种专门生 产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记和所有 的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化 的5x浓度反应
5、缓冲液。杂交根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核 酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易 和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的 地咼辛标记探针再次杂父。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab 段，然后米用即时可用的化学发光底物NBT/BCIP可以看 到杂交结果。应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交 样品材料至少lOObp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者DNA超螺旋的DNA实验时间步骤反应时间DNA标记1h-O/N杂交6 h or O/N免疫检测1.5h显色0.5-16h检测数量一个试剂盒足够用于：25
6、个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3yg； 并可以检测50张10x10cm2的杂交膜。质量控制根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA【pBR328】进行标记，并按 照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg同源DNA点在膜上16h后成色 显影检测。试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15 到-25 C （保质期印在标 签上）。在干冰中运输。一旦开圭寸，请根据下表选择适宜的储存条件。试剂盒成分储存条件抗地咼辛碱性磷酸酶结合物（8号管）2-8 C稳定。NBT/BCIP（9号管）2-8 C，避光保存 或者15-25 C保存4周圭寸阻液（10号管）未开封时，2
7、-8C或者15-25C稳定；旦开封，应分装并储存在-15C到 -25 C或者无菌条件下2-8 C间可以稳定 保存1个月；工作溶液都应是新鲜配制的灵敏度和特异性采用southern杂交从lyg人胎盘DNA （经Bgl II或EcoR I酶切）中检测到 单拷贝基因。3实验步骤和所需材料31在你开始前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示:要求指引在清洁的条件下进行操作高压灭菌地高辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括：SDS，吐温20，并 应该加入到已灭菌的溶液中。用干净的孵育托盘每次使用前都要严格地清洗实验托盘处理膜的要求带无粉手套处理膜的时候，只能够用干净的镊子夹 膜的边缘3.2流程图
8、3.3部分地高辛标记DNA3.4部分标记效率的检测3.5部分DNA固定i3.6部分杂交3.7部分免疫检测i3.8部分洗脱和DNA斑点与另一探针的杂交3.3地高辛标记DNA介绍随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP这一标记采用的是地高辛高效引 物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5x浓度标记混合物，其中 dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反 应缓冲液。附加设备和所需试剂水浴冰水混合物此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。溶液成分储存条件/稳定性用途水咼压灭菌的双蒸 水15-25 C，稳定稀释DNAEDTA（
9、乙二胺四乙 酸）0.2M EDTA,pH 8.015-25 C，稳定终止标记反应模板DNA：模板DNA所需特征:特征详细信息纯度模板 DNA 应该采用 the High Pure Plasmid Isolation Kit 进行制 备。当采用其他商业化的纯化试剂盒进行纯化时，我们建议额外进 行一次苯酚/氯仿抽提以去除残余的蛋白质。在标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用， 那么此步骤也是需要进行的。大小为了获得理想的结果，模板DNA应该线性化，且大小应该在 100-10000bp以上。如果模板DNA大于10kb，那么在标记之 前应该采用限制性酶切序列为4个核苷酸的限制性酶（如Hae
10、 III）对模板进行酶解。数量上面步骤描述原则上10ng-3“g的模板均可以标记上，然而请 仔细查看在给定的表中，用于你的杂交实验所需的探针。可以 根据提供的操作方法放大总体积和成分用量来获得更大量的标记探针。如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，需标记的 模板DNA用量至少300ng （探针浓度：25ng/mL杂交液）。标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA如果你想要完成基因组的southern杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插 入载体的模板DNA从载体上分离出来。为了从凝胶中分离DNA，你可以用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒（the Agarose Gel DNA Extraction Kit）进行大小
11、在400bp-5kbp范围内DNA片段的回收。这一 试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后，不需要进 一步纯化即可对DNA片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的探针应该用高 效的PCR产物纯化试剂盒（High Pure PCR Product Purification Kit）进行纯化， 以去除残留的琼脂糖颗粒。步骤此步骤用于标记10ng-3yg DNA。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量 的DNA （最咼达10yg）。操作向一个反应管仲中加入10ng-3yg模板DNA （线性或超螺旋）和高压灭菌1的双蒸水，终体积达15卩1；作为对照，向另一管中加入5卩1无标记对照DN
12、A（Vial 2）和高压灭菌水，终体积达15卩1沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中2注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的加入以下试剂到变性探针或对照DNA中:试剂体积Vial 52yLVial 62yLVial 7lyL充分混合并简单离心;37 C孵育1小时或者过夜注意：较长的孵育时间（最高达20小时）能够提高地高辛标记DNA的产 量加入2吐0.2M EDTA（pH8.0）和/或65C加热10分钟终止反应4 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp到1 OOObp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长度标记反应的产量表1:此表向您展示了在
13、适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每 个实验采用lyg DNA作为模板。1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了 0.8腿 新合成的地高辛标记DNA中。20小时后消耗了大约38%的核苷酸。模板DNA1h20h10 ng15 ng50 ng30 ng30 ng120 ng100 ng60 ng260 ng300 ng120 ng500 ng1000 ng260 ng780 ng3000 ng530 ng890 ng使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应 1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定, 并通过斑点杂交
14、进行证实(10个独立标记实验的平均值)。3.4标记效率的确定介绍地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十 分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信 号弱。实验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。步骤描述1将地咼辛标记DNA的 系列稀释梯度点到 小块带正电何的 尼龙膜上；尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对 照DNA (Vial 4)作为标准。2采用anti-DIG-AP结合物(Vial 8)和随时即用的NBT/BCIP对尼 龙膜进行免疫检测。比较地高辛标记DNA与对照DNA的一系列稀释点的强度确 定标记效率。所需附加溶液的制备请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗 涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M马来酸0.15M NaCl pH 7.5(20 C)0.3% (v/v)Tween2015-25 C,稳定去除未结合的抗 体马来酸缓冲液0.1
