《纤维素合成酶互动蛋白1连接微管和纤维素 合成酶复合物》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纤维素合成酶互动蛋白1连接微管和纤维素 合成酶复合物（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、纤维素合成酶互动蛋白1（CSI1）连接微管和纤维素合成酶复合物%址摘 要：可通过活细胞成像观察到CESA复合体沿着与并行于底层的皮层微管的轨迹移动。本文报道了 CESA互动蛋白1即CSI1是一种连接CESA与皮层微管的微管相关蛋白。CSI1、CESA复合体、微管的活细胞同时成像，表明CESA和皮层微管的联系依赖于CSI1。体外微管结合试验法证实了 CSI1直接结合到微管上。关键词:细胞扩张；纤维素；细胞壁引言：植物细胞最终的形态的控制，主要由细胞壁产生的均匀外部膨压与非均质的抵消 阻力共同作用而产生的均质性的扩张造成的。纤维素微管是在细胞壁作为主要的承载 聚合物，是形成不对称细胞膨压的主要部件
2、1。在生长中的细胞中，纤维素微纤维正 沿着主轴延伸的方向横向铺设，从而形成弹簧状结构，这种结构加强了细胞侧向及纵 向的扩展。关于植物细胞如何设定纤维素微管空间定位的主要理论已经涉及到皮层微 管的研究卜刀。据报道称，皮层微管的定位取向与在许多不同类型的细胞纤维素合成 期间的纤维素微纤维类似2 4，而且经不同的微管抑制剂处理过的造成皮层微管的紊 乱也导致了纤维素微纤维沉积方式的混乱8-11。在研究微管在纤维素合成的作用时，一个改进的试验方法通过使皮层微管及纤维 素合酶复合体同时可视化而成功12。CESA复合体可由活细胞成像直接观察到CESA 复合体沿着细胞质膜在平行于底层的皮层微管的轨迹移动。当微
3、管组织经安磺灵（一 种微管抑制除草剂）处理后变得混乱时，CESA复合体的成分的轨迹也随之改变12。 上述这些实验为验证皮层微管的空间取向定位确定了纤维素微纤维沉积的空间定位 提供了有力的证据。然而，这个观点有些过于简单化，因为还存在一些诸如在没有微 管时纤维素微纤维出现明显的对齐现象，并且微管与纤维素合酶复合体的交互链接的 机制尚未阐明。在此，我们提出最近确认的CESA链接蛋白1（CSI1）介导着微管 与纤维素合酶之间的交互链接的结论。实验结果：1.CSI1与皮层微管共区域化CESA复合体仅仅沿着平行于微管的轨迹移动【12-成。在载有YFP-TUA5（黄色荧 光a-微管蛋白）和（RFP）-CS
4、I 1（红色荧光纤维素合酶链接蛋白1）的转基因线上，检 测CSI1是否与微管链接。如图.1A中，（RFP）-CSI1信号与YFP-TUA5的有很大部分 的重叠，及图.1B中信号强度表。进一步的确定CSI1和微管的空间关系，将之定义 为共区域化。在表达RFP-CSI1及YFP-TUA5的细胞单束光照射部分，观察到84 土 4%RFP-CSI1粒子与微管对齐链接（图.1C及表1）。在RFP-CSI1与YFP-TUA5 之间广泛的匹配安装，表明了 RFP-CSI1绑定链接在皮层微管上（图.1D）。下一步检测微管与CSI1之间的广泛的共区域化是否会随着时间的改变而有所变 化。RFP-CSI1与YFP-
5、TUA5的延时观测，显示了在一定的时间段内两种分子系统的 动态行为（movie S1）微管是高度动态的并且以0.5 m/min的平均净增长速度经历了 “踏车运动”的过程。观察到RFP-CSI1粒子系统沿着与微管重合的轨迹移动，且没有 连接微管末端的倾向。因此这些动力学行为，在任意给定的时间内，微管末端与相关 亚祖分之间的链接协同易受到快速变化，这种效应可能是因为CSI1和微管的共区域 化的不完美之处。图1.CSI1与皮层微管共区域化。Table 1. Quantification of colocalization among CSI1, CESA complexes, and microtu
6、bulesRFP-CSI1 (A) vs. GFP-CESA6 (B)RFP-CSI1 (A) vs. YFP-TUA5 (B)YFP-CESA6 (A) vs. RFP-TUA5 (B) in WTYFP-CESA6 (A) vs. RFP-TUA5 (B) in csi1No. of colocalized voxels509489555643% of material A/B colocalized91 2%*/75 3%于84 4%73 4%47 11%P value0.0010.0010.0010.111% expected random colocalized41 3%*/38 3
7、%*49 6%46 6%43 6%*The percentage of RFP-CSI1 particles colocalized with GFP-CESA6.The percentage of GFP-CESA6 partides colocalized with RFP-CSI1.Table 1. Quantification of colocalization among CSI1, CESAcomplexes, and microtubules 表格1： CSI1, CESA复合体，及微管之间的共区域化的量化2.CSI1是一种微管绑定蛋白CSI1与微管的链接可能通过直接绑定到微管或
8、者绑定到微管相关蛋白（MAPs） 完成的。CSI1有许多（ARM）犰狳重复横跨于整个蛋白。几个包含ARM重复的蛋 白质最近经证实与微管相互作用16-19。为了测试CSI1直接绑定微管的可能性，进行 体外微管绑定分析法20, 21。微管于体外聚合并与已知的与微管相关的蛋白质（MAP2, 阳性控制），BSA（阴性控制），或者亲和纯化，他-标记CSI1已经在大肠杆菌中表达。 经孵化后，样品经离心分离，存于沉淀与上清液中的蛋白质经SDS/PAGE（图.2A） 电泳分析检测，不像BSA但与MAP2类似，CSI1与聚合的微管共同沉淀。在没有微 管时，CSI1仍存于上清液。为测定CSI1对微管的亲和力，饱和
9、绑定实验在含有各种 不同量的紫杉醇稳定的且恒量的他标记的CSI1微管的环境中进行。CSI1绑定到微管 在2 p M时是饱和的，解离常数Kd= 1.07 土 0.33 p M（图.2B及图.S1），这个数值 与得到确认的微管绑定蛋白的解离常数相当【22, 23。图2： CSI1是一种微管绑定蛋白3.CSI1的共区域化依赖于微管和CESA复合体为确定CSI1的共区域化至细胞质膜是否依赖于微管的功能，用微管紊乱药物安 磺灵处理同时表达CSI1-RFP和GFP-MAP4-MBD的拟南芥种苗。用20p M的安磺 灵处理7小时，除去生长在黑暗条件下的种苗的表皮细胞里的微管组织，随之在CSI1 组织中引起明
10、显的变化（图.S2）。CSI1粒子显现出紊乱无序，且荧光信号更分散。通 过对比，安磺灵处理未能阻断CESA复合体在线性轨迹上移动12。我们在同时表达 CSI1-RFP an和GFPCESA6的拟南芥种苗中验证了安磺灵的效应。正如预期，用20 N 安磺灵处理10小时后，并没能明显的将GFP-CESA6 （绿色荧光蛋白）从细胞质膜上 移除，而且荧光信号继续集中于线性轨迹上，即使移动速度有轻微的减少（图.3A and 视频S2）。在同样的种苗中，黄安灵处理后引起CSI1-RFP信号混乱，并且大部分 CSI1-RFP粒子的信号强度与背景的噪声并没有多少区别。因此，CSI1的分布较之 CESA的分布对于
11、皮层微管的缺失更敏感。为了确定CESA复合体的完整性对于CSI1的质膜共区域化是否重要，用纤维素 抑制剂异恶草胺表达CSI1-RFP的拟南芥种苗。异恶草胺的作用是快速从质膜上清除 CESA复合体。加入异恶草胺30分钟后，观察到CSI1-RFP粒子强度明显降低（图. S3），经测异恶草胺作用后的CESA复合体也有类似变化。大部分CSI1-RFP信号 是分散的，而且没有很明显地超出背景噪声的强度。图3.在共区域化变化经安磺灵处理变现适当的差别4. CESA的移动速度依赖于微管尽管皮层微管微纤维沉积的理论在大多数情况下被广泛认可，但微管的功能是否 延伸到纤维素合成的其他属性上仍是一个未解问题。虽然经
12、安磺灵处理后 GFP-CESA6粒子形成线性轨迹，但观察到它们的速度明显的降低了（图.3B及视频 S3），且轨迹要短于未被处理的细胞（n=25个细胞）（图.3A及视频S3）。在用20 M 安磺灵处理10小时的细胞了，GFP-CESA6粒子的平均速度从353 + 68 nm/min （n = 603） to 245 + 72 nm/min（n=349），减少量超过30%。更长时间16小时的安磺灵处理 后平均速度降低达到54%（189 + 45 nm/min, n = 381）。5. CSI1功能损失的安磺灵拟表型效果如果CSI1通过其与微管的相互作用发挥功能，那么我们就可以预测的微管的损 失将与
13、CSI1的损失具有类似的效果。通过比较csi1-3无效突变体与经安磺灵处理的 野生型植株作比较来验证这个假设。安磺灵对野生型苗的效应，表现为伸长率的下降 和径向膨胀的刺激。有趣的是，安磺灵在csi1下胚轴遗传表型为各向异性生长缺陷。 有趣的是，黄草消拟表型的的各向异性生长缺陷csi1（图s. S4和S5A）。如果CSI1 介导微管和CESA复合物之间的相互作用，然后我们可以预测，csi1下胚轴对安磺灵 是不敏感的。事实上，对于在经持续增加的浓度的安磺灵量处理，在暗处生长4天的 拟南芥的下胚轴长度的量化结果表明csi1-3对较高浓度的安磺灵是不太敏感的。（图.S5B）。接下来，我们研究“CESA
14、复合体速度（图.S5 C-F）。在csi1-3里的GFP-CESA6 粒子的平均速度（图.S5 C F）与在长时间安磺灵处理的野生型的难以区分（图.S5F）。 此外，用安磺灵处理csil苗，10或16小时，没有造成CESA运动速度进一步降低。 综上所述，这些数据与安磺灵在形态学上一些效应，基本上在CESA速率的所有效应 都是通过CSI1介导的理论相容。6 .CSI1的损失使CESA复合体合物从微管上解离CSI1的损失对CESA复合物的动力学有很显著的效果，即由微管的损失引起完 全的拟表型（图.S4）。因此，接着我们研究未经任何处理的csi1苗的微管和CESA复 合物之间的关系。观察同时表达RF
15、P-TUA5和YFP-CESA6的野生型的光学切片， 超过734%，YFP-CESA6粒子（n =6细胞来自六个幼苗）与微管连接（图.4和表1 ）。 相比之下，在csi1-3中，约4711%的YFP-CESA6粒子在细胞中（n=6细胞，五个 幼苗）与微管连接（图.4和视频S4），重叠的程度与随机共区域化（436%）没多 大区别（表1）。这些结果表明CSI1介导CESA复合物与微管之间的直接互动作用。先刖CESGon心对 了双通道行共 上 RFP-CSI1 f 布形式却不同,携皮层微的系依赖于CSI1聚焦显微镜的分辨水平上，RFP标记的CSI1表现出至少部分与 共区域化24】。了更仔细地检查CSI1和CESA复合物之间的空间 一 RFP-CS1和GFP-CESA6的并在黑暗中生长的下胚轴表皮细胞进 芝焦成像，前面提到RFP-CSI1和GFP-CESA3的共存甲，在质6的有广泛重叠。但，尽管其广泛的重叠，其勺信如在JGFI）共（图S和信号强度图，如图S6B。共定位的量化结果 n = 5个细胞，自五个幼苗）与RFP-CSI1粒子 明共区域化的相似性，这两个分子组份的动力 FPCSI1 的平均速度为 337157nm/min 的（n =686 粒）GFP-CESA6 的为 361 163 nm /min （n
