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1、 欢迎阅读本文档，希望本文档能对您有所帮助!微藻的实验室培养学生：林晓生 学号：2120180414导师：杨缜教授一、藻类的概述 藻类是原生生物界一类真核生物(有些也为原核生物，如蓝藻门的藻类）。主要水生，无维管束，能进行光合作用。藻类植物共约为2100属,27000种。根据所含色素、细胞构造、生殖方法和生殖器官构造的不同，分为绿藻门、 裸藻门、轮藻门、 金藻门、黄藻门、硅藻门、甲藻门、蓝藻门、褐藻门和红藻门。色素的颜色划分，藻可分为3类：绿藻、褐藻和红藻。 由于单胞藻具有利用太阳光能效率高、营养丰富、生长繁殖迅速、对环境的适应性强和容易培养等重要特性，因而受到重视。微藻是一类在陆地、海洋分布
2、广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。二、微藻的营养模式和生长模式（二）、微藻的生长模式 藻类在培养过程中，生长繁殖的速度，出现一定的起伏，这种生长模式可划分为五个时期（延缓期、指数生长期、相对生长下降期、静止期、死亡期）。三、培养按培养的场所分室内培养和室外培养1） 按培养基的形态分固体培养和液体培养 2）按培养的纯度分 纯种培养 和 单种培养3）按藻液的流动情况分静止培养和循环流动水培养 4）按气体交换情况分充气培养和不充气培养 5）按藻液与外界接触程度分封闭式培养和开放式培养 6）按培养规
3、模和目的分小型培养、中继培养和大量培养方式简单介绍其中的四种方式：（1） 纯培养和单种培养纯培养（axenic culture）：是无菌培养，指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养操作要求十分严格，要求有无菌室、超净台等设备，容器、工具、培养液等均须彻底灭菌。培养成功率很高，是进行科学研究不可缺少的技术。单种培养（single-species culture）：指区别于纯培养的不排除细菌存在的培养（可以是生产性的，也可以是非生产性的）（2） 封闭式培养和开放式培养封闭式培养（closed culture）：指把培养液密封在透明的容器中，与外界空气隔离，暴露在阳光中，CO2完全
4、采用人工供给的方法。各种反应器等开放式培养：指把藻类培养在开敞容器中，如广口玻璃瓶、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池等。封闭式塑料薄膜袋培养，方法简单，成本低、培养的藻细胞密度大，不易污染且生产周期短，效果很好。（3） 小型培养、中继培养和大量培养小型培养：一级培养，目的是培养和供应藻种，用于科研等。一般采用封闭式不充气一次性培养方式，培养容器一般采用1003000ml的三角烧瓶。中继培养：又称二级培养，目的是藻种扩大培养，供应生产性大量培养的藻种。一般在室内大的玻璃容器或塑料大袋中进行。大量培养：也叫三级培养，目的是为培养动物提供大量单胞藻饵料。有室内和室外两种。目前主要采取室内、开放式、通气、一
5、次性或半连续培养法，培养容器有大型玻璃钢水槽、大型水泥池或塑料薄膜袋等（也有用土池）。单胞藻生产性扩大培养常用流程500mL藻种5000mL三角烧瓶细口玻璃瓶塑料桶封闭式塑料薄膜水泥池一级培养二级培养三级培养四、实验室培养过程1.消毒2.配制培养液3.接种4.培养管理5.收获1容器、工具和水消毒方法总结一级培养（实验室的培养）：金属器具和试管口、瓶口：直接灼烧；玻璃器皿：洗液+烘箱；纸、棉花、纱布：烘箱；培养用水：砂滤水脱脂棉煮沸冷却（洗液：15g重铬酸钾+200mg浓硫酸混匀）2.培养液和培养基的配方配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍比较常用的几种： 水生4号和克诺普（Knop）
6、培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见表1。以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5琼脂。从以上各种配方，可看到配制藻类培养液的几条原则：（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适
7、合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。（4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。3.藻种分离方法：常用下列四种。1）微吸管（毛细管）分离 选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培
8、养皿中接2030个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（10005000单位或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且适于分离个体较大藻类。2）水滴分离法 用微吸管吸取稀释适度藻液，滴到消毒过载片上，水滴尽可能滴小些，要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。一个载片上滴24滴，间隔一定距离，作直线排列。如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液，把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。如未成功，需反复
9、重做，直到达到目的。此法简便易行，尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。操作时同样要求细致、认真，使用工具及培养液经严格消毒。3）稀释分离法 把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞（也可能一个都没有，也可能有两个），在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。此
10、法操作简单易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果好。4）平板分离法 这个方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞子，进行培养。此法较繁，但难度不大，而且可看到是否污染杂菌，对于分离
11、已污染杂菌培养液的藻类更合适。5）底栖藻的分离 在显微镜或放大镜下挑取个体，一般可接种在固体培养基平板上，反复挑选、培养。6）分离浮游蓝藻 可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分离硅藻则可利用其易沉淀的特性。 用以上各种方法分离到藻种，需放在适宜光照条件下（靠南或北窗口附近光线充足处，但严防阳光直射）培养，有条件的可控制温度和利用人工光源。培养时，每天轻轻摇动12次，但需注意勿把培养液沾湿棉塞，避免杂菌污染。经一段时间后，培养物颜色逐渐变深。再经一次显微镜检查，如无其他混杂生物，才达到单种培养目的。4藻种的选择： 特征：生长迅速；对极端的温度和辐射条件的耐性范围大；蛋白质，脂类和糖类含量高，或
12、有选择地积累一种特殊的代谢产物（如甘油）；无毒性，且易于收获。根据系统的要求和特殊的方法，还可有其他要求。5.接种： 在分离到单纯藻群后，就可接种到培养液中进行培养，进而移养扩大培养。 液体接种：是将藻液直接加入培养液中进行搅拌，水温较低（10以内）时，多加；约占培养液总量的3040左右，水温适宜时（2530左右），可加58左右。按种后瓶口用灭菌纸包扎，放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。大约二周后进行一次移植。藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保持不受其他生物污染。6藻种的保藏 可接在固体培养基上，在常温、弱光下保藏半年到一年；也可在低温下（冰箱内）保藏，每天接受短时间（几个小时
13、）弱光，可保藏23年；如不照光，只能保藏几个月。保藏藻种所用培养基的营养成分浓度应比正常培养基高一些，一般可增加一倍，琼脂量为11.5。也可在固体培养基上，再加培养液，然后接种到培养液中，可以避免固体培养基干涸，保藏效果比单用固体好。7.培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下因素：1）二氧化碳浓度在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.15之间。2）光照强度 利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直
14、射光照射。或利用人工光源（60100瓦电灯或日光灯），需15003000勒克斯/厘米2。3）温度 适温一般在1030之间，最适温常为2025。若在室外培养，夏季中午高温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。在夏季，不要把藻类培养物放在直射太阳光下，而要放在凉爽的场所，例如向北窗台上。在秋、冬季节，如希望藻类保持积极生活活动状态，就要把培养物移到有人工光照处。4）无机营养 应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。5）注意pH变化 如变动过大，可用酸、碱调节。6）适当控制培养物中藻细胞浓度 过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范围内。
15、7）及时观察和检查藻类生长情况 可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。藻种和中继培养每半月进行一次全面显微镜检查。大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：了解藻细胞生长情况，并检查有无敌害生物污染。8采收： 培养液中藻体的适时采收，既是培养的目的，也是继续培养的手段。因为通过采收一部分藻体，可使藻细胞浓度保持恒定。通常在培养物细胞浓度达到干重0.40.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻体。 采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入23明矾或6饱和石灰水。约12小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、烘干。在大型培养池中采收藻体，可另外设计适当的工艺流程。根据水色的由浅变深.例如绿藻类：由嫩绿色变为深绿色；硅藻类：由浅褐色变为深褐色；金藻类：金黄色 感谢阅读本文档，希望本文档能对您有所帮助!
