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1、甲壳动物酚氧化酶原激活系统1 概述甲壳动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的非特异性 免疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。非特异性免疫系统是一种比 较原始的免疫系统，它存在于所有多细胞生物体，是免疫防御的第一线，分为细 胞免疫和体液免疫。甲壳动物的细胞免疫包括吞噬作用、包围化及结节的形成； 体液免疫包括酚氧化酶原激活系统(prophenoloxidase activating system, proPO系 统)、各种凝集素及抗菌肽等。proPO 系统是一种类似于脊椎动物补体系统的酶级联系统，在甲壳动物的非 特异性免疫系统中起着非常重要的作用。它由酚氧化酶(phenol
2、oxidase, PO)、酚 氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、丝氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)、模式 识别蛋白(patten recognition proteins， PRPs)和蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor) 等构成。该系统中的因子以非活化状态存在于血颗粒细胞中，极微量的微生物多 糖如卩-1,3-葡聚糖(卩-1,3-glucans,阻)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖 (peptidoglycan , PGN)等和钙离子、胰蛋白、SDS可激活该系统，使proPO变成 PO,
3、并产生一系列有生理活性的物质，通过包囊与黑化作用抑制和杀死病原体， 达到免疫效果。另外其在表皮硬化和伤口愈合中也发挥着重要的作用。2 proPO激活系统相关因子2.1 模式识别蛋白(patten recognition proteins, PRPs)无脊椎动物行使非特异性免疫反应首先是通过体内特定蛋白对病原微生物 表面的病原相关分子模式(pathogen- associated molecular patterns , RAMPs)，包括 革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、革兰氏阳性菌的肽聚糖 (peptidoglycan , PGN)及真菌的p-1,3-
4、葡聚糖(卩-1,3-glucans, pG)进行识别，这种特 定蛋白就称为模式识别蛋白(patten recognition proteins，PRPs)。PRPs包括肽聚糖 识别蛋白(the peptidoglycan-recognition proteins, PGRPs)、革兰氏阳性菌结合蛋白 (Gram-negative-binding proteins, GNBPs)、p-葡聚糖结合蛋白(p-glucan-binding proteins, pGBPs)、脂多糖和 p-1,3-葡聚糖结合蛋白(LPS and p-1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)、
5、C 型凝集素(C-type lectins)、Toll 样受体(Toll-like receptors)o Toll 样受体虽然在脊椎动物中作为一种模式识别受体发挥作用 ,但是在无脊椎动物中 这类受体并不与病原体直接接触,而是作为一种跨膜的信号转导分子行使功能。 通常情况下 PRPs 在异物入侵前位于血浆或血细胞表面，具有对多糖的亲和性。 当微生物感染生物体时，PRPs首先与微生物细胞壁上的多糖结合，然后通过与 血细胞表面特异受体联结促进颗粒细胞扩张，引发包裹、吞噬、 proPO 系统级 联发应等，实施机体的非特异性免疫反应。2.1.1 0-葡聚糖结合蛋白(卩-gucan-binding pr
6、oteins, pGBPs)1992年，Duvic B等从淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)血细胞中纯化到 卩GBP结合蛋白，并对其部分特性进行研究。卩GBP在肝胰腺转录，其编码的蛋 白被释放到血淋巴中，并与卩-1,3-葡聚糖结合，促进proPO系统的激活。从凡纳 滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)分离获得 与淡水螯虾(Pleniusculus)卩GBP相似的蛋白，其氨基酸序列与卩GBP相似性约为 70%，被命名为卩GBP-HDL。PGBP/PGBP-HDL家族包含两个与微生物葡聚糖酶 催
7、化域序列相似性很高的基序，但是它们不具有葡聚糖酶活性，而具有整合蛋白 基序作为假定的细胞粘附位点。已从加州对(Penaeus californiensis)细角滨对 虾(Litopenaeus stylirostris)、凡纳滨对虾(L.vannamei)和中国明对虾(Fchinensis)分 离并克隆了 PGBP/PGBP-HDL家族基因。凡纳滨对虾(L.vannamei) PGBP-HDL在肝胰腺、肌肉、游泳足和鳃中表达， 在血细胞中不表达；中国明对虾(F.chinensis) PGBP-HDL在肠、肝胰腺、肌肉和 鳃和血细胞中均有表达，且在感染白斑综合症病毒后其表达情况发生改变。尽管 对
8、虾PGBP-HDL mRNA在多种组织中均有转录，但PGBP-HDL蛋白仅存在于血 淋巴中。在P-1,3-葡聚糖存在的下，分离纯化的PGBP能够激活加州对虾(P.californiensis)酚氧化酶活性，因此PGBP-HDL可能是对虾proPO激活路径中 识别P-1,3-葡聚糖的一种模式识别蛋白。2.1.2 脂多糖和 0-1,3-葡聚糖结合蛋白(LPS and 0-1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)LGBPs最初从淡水螯虾(Pleniusculus)分离获得，与昆虫GNBPs具有较高的 同源性，LGBPs与LPS或P-1,3-葡聚糖的结合能够激活proPO
9、系统。目前已克 隆获得淡水螯虾(P.leniusculus)凡纳滨对虾(L.vannamei)、中国明对虾(F.chinensis)、 日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)和斑节对虾(Penaeus monodon) LGBPs 基因。 大多数LGBP成熟蛋白的平均分子量为39.840.2kDa，含有一个由多聚糖结合 基序、葡聚糖酶基序、0葡聚糖识别基序以及两个精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸基序。 LGBP mRNA主要在血细胞中表达，在感染白斑综合症病毒或革兰氏阴性菌及其 脂多糖早期一中期，LGBP mRNA表达水平上调，表明LGBP是一种与免疫应答 有关的基因。2.1.3
10、C 型凝集素(C-type lectins)C 型凝集素是糖类结合蛋白，在脊椎动物和无脊椎动物的生物过程中具有重 要作用。 Changlin Chen 首次在蟑螂报道了凝集素与 proPO 系统的联系，分离纯 化的血清凝集素能够激活蟑螂血淋巴的 proPO 系统，并能增强海带多糖对 proPO 系统的激活。在烟草天蛾发现了两种 C 型凝集素，分别命名为 IML-1 和 IML-2， 被认为是昆虫血淋巴 proPO 系统激活所需要的模式识别蛋白。近期，在淡水螯虾(P.leniusculus)证明了 C型凝集素与proPO系统激活之间 的联系。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)C
11、型凝集素PcLec2是参与proPO系统 激活的一种模式识别蛋白，同时，淡水螯虾(Pleniusculus)C型凝集素 甘露糖 结合凝集素(mannose-binding lectin, Pl- MBL)在颗粒细胞中合成，在受到感染后 通过胞吐作用排出，具有调节 proPO 系统的作用。已从对虾中鉴定了一些 C 型 凝集素并对其生化特征予以描述，但有关其在对虾 proPO 系统激活中的潜在作 用却知之甚少。近期有研究表明，凡纳滨对虾(L.vannamei)C型凝集素能增强血 淋巴中酚氧化酶的活性。然而，对虾 proPO 系统激活的分子机制还有待进一步 阐明。2.2 丝氨酸蛋白酶(serine
12、proteinases, SPs)丝氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)是一类以丝氨酸为活性中心的蛋白水 解酶，不仅参与机体消化、胚胎发育、组织重建、细胞分化及血管形成等过程， 而且在抵御病原体入侵的过程中起着非常重要的作用。参与免疫反应的 SPs 通 常以酶原的形式合成，储存在膜泡内或颗粒中，然后被转运或释放到细胞外，通 过与特异的蛋白酶结合，在其活性位点水解断裂，使之活化，形成级联反应，并 快速启动相应的免疫防御系统，抵御病原体的感染。丝氨酸蛋白酶的活性部位都含有组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，形成催化三联 体。目前，已在昆虫和甲壳动物中发现了几种参与proPO系统激活的
13、SPs，它们 都属于含有发夹结构域的丝氨酸蛋白酶 (Clip-domain serine proteinase , Clip-SPs) 。Clip-SPs通常以酶原的形式合成，其N端具有12个Clip结构域，C端起催化 作用的SP结构域。Clip结构域通常由3755个氨基酸残基组成，并通过3个 严格保守的二硫键相互连接，形成紧凑结构，进而通过2392个氨基酸残基与 SP 结构域连接。Clip-SPs分为具催化活性的SPs和无催化活性的SPs丝氨酸蛋白酶同源 物(Clip-SP homologs, Clip-SPHs)，二者的氨基酸序列相似，但 Clip-SPHs 由于一 个或多个催化残基的缺失
14、或突变导致其明显缺乏酰胺酶活力(如：Clip-SPHs催化 三联体中的丝氨酸被甘氨酸取代)，目前已有文献证实，SPHs在节肢动物中参与 酚氧化酶原系统的激活和抗微生物应答。 Rattanachai 等(2005)从日本囊对虾中克 隆到了一个SPHs基因，发现基因的表达量在投喂含有肽聚糖的饵料后有显著增 加；Jitvaropas等(2009)从斑节对虾的血淋巴细胞中克隆得到了一个SPHs基因， 经过分子克隆和体外表达获得的蛋白具有细胞粘附、抑菌等生物学活性；杨燚等 (2012)从中国明对虾血细胞中克隆获得了一个 SPHs 基因， 细菌和对虾白斑综合 症病毒(WSSV)刺激后该基因在血细胞中的表达
15、会显著上调。已证明，当没有 SPHs时，proPO能够被PAP在正确的位置裂解，但是却不能显现PO的活性。 因此有人推断,SPs和SPHs的发夹结构域似乎对proPO的活化作用很关键,SPHs 很可能改变了 PO的构象而导致其活化，但目前SPHs与PO之间的直接反应关 系还没有被确认。2.3 酚氧化酶(phenoloXdase, PO)和酚氧化酶原(ProphenoloXdase, proPO)酚氧化酶(phenoloxidase, PO)又称为酪氨酸酶(tyrosinase)，在无脊椎动物和脊 椎动物中都有发现，其活性部位是由2个铜原子(CuA和CuB)，能够催化酚类物 质形成最终的反应产物
16、黑色素。无脊椎动物PO 一般以无活性状态的proPO存 在， ProPO 产生于血淋巴中成熟的血细胞，如颗粒细胞和半颗粒细胞，经丝氨酸 蛋白酶裂解变成有活性的POo 1996年，Sugumaran建议：酪氨酸酶这个名字应 专门用于哺乳类，而PO专门用于无脊椎动物FujimotoK对它们进行序列分析， 结果显示它们来源于两个相对独立的分支，从序列相似性考虑，酪氨酸酶可能起 源于软体动物的血蓝蛋白， PO 可能起源于节肢动物的血蓝蛋白。PO 能够催化单酚羟化成二酚，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成 最终的反应产物黑色素。这些黑色素协同具有细胞毒性的醌类中间产物沉积到入 侵的病原体周围，起到隔离杀死病原体的作用，即所谓的黑化包被反应。在较高 等的无脊椎动物如节肢动物中，PO具有多种功能，它不仅参与黑色素形成、角 质的硬化和伤口愈合，而且在宿主的防御反应中还作为非自身识别系统发挥功能 在识别异物、释放调理素(opsoni n)、促进血细胞的吞噬和包囊反应以及促进颗粒 细胞和半
