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1、第二章生物样品与样品制备1.体内药分的对象：人体和动物体液、组织、器官、排泄物体内药物分析的特点:样品量少，不易重新获得；样品复杂，干扰杂质多；供临床用药监护的检测分析方法要求简便、快速、准确，以便迅速为临床提供设计合理的用药方案及中毒解救措施;实验室拥有多种仪器设备，可进行多项分析工作；工作量大,测定数据的处理和阐明有时不太容易。需相关学科参与。体内药物分析样品的种类：最常用且易获得的分析样品有：血样、尿样、唾液和粪便。特殊情况下:乳汁、泪液、脊髓液、胆汁、羊水、各种组织4。血清：血清是由血液中纤维蛋白原等的影响引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，约为全血的55。尿液:尿液的主要成分:水、含氮
2、化合物、盐类;体内药物清除主要通过尿液排出,药物以其原型或代谢物及其缀合物等形式排出；尿药测定主要用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、药物代谢率的研究，并可推断患者是否按医嘱用药.6生物样品分析的前处理：是指测定生物样品中的药物及其代谢物时，对样品进行分离、纯化、浓集，必要时对待测组分进行衍生化，为测定创造良好的条件。7为何进行前处理？）药物进入体内除原药外还有多种形式存在)生物样品的介质组成比较复杂，尤其蛋白质严重影响分离效果，必须进行前处理）除去介质中含有的大量内源性物质等杂质,提取出低浓度的被测药物,同时浓集药物或代谢物的浓度，使其在所用分析技术的检测范围内.。生物样品处理方法选择的
3、一般原则：待测药物的理化性质；待测药物测定的目的与浓度范围。9去除蛋白质的方法：加与水相混溶的有机溶剂;加入中性盐；加入强酸;加入含锌盐及铜盐的沉淀剂;酶解法.0生物样品的分析由两步组成:样品的前处理(分离、纯化与浓集)和对提取物的仪器分析；提取法是应用最多的分离、纯化方法;提取的目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分药物及其代谢物,并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集,以供测定;提取法分为液液提取法和液-固提取法.11提取溶剂的选择:对被测组分的溶解度大,沸点低,易于浓集、挥散,与水不相混溶，无毒、化学稳定、不易乳化；最常用的溶剂是乙醚和氯仿。12被测组分的浓集:样品在提取过程中被测组分得到纯
4、化但因微量的组分分布在较大体积的提取溶剂中，由于进样量的限制，被测组分量可能达不到检测灵敏度，故需将被测组分浓集后再测定;两种浓集方法:末次提取时加入提取液尽量少；挥去提取溶剂法。1分离前将药物进行衍生化的目的：使药物变成具有能分离的性质；提高检测的灵敏度；增强药物的稳定性;提高对光学异构体分离的能力;G中的化学衍生化和HC中的化学衍生化。第三章 体内药物分析方法的设计与验证1。生物样品经处理后,需选择适当的分析方法进行测定,目前供生物样品药物及其代谢物监测的分析方法主要有以下五类:光谱分析法；色谱法；毛细管电泳法；免疫分析法;同位素法2。体内药物分析方法的选择原则：一般要根据药物的结构、物理
5、性质、体内药物浓度大小、干扰成分的多少、样品的预处理方法、实验条件和目的等因素进行综合考虑,方可选择出可供生物样品中药物及其代谢物含量测定的分析方法。3体内药物分析方法设计的主要依据：（）明确分析方法的目的要求;(）调研文献了解待测药物的特性；(3）仪器设备与实验室条件。4体内药物分析方法设立与建立的一般步骤:依据测定目的要求结合药物结构、理化性质及体内存在状态、参考同类药物的文献资料，先拟定初步的分析方法进行一系列的体外和体内试验工作以选择最合适的实验条件,进一步验证所拟定的分析方法是否适应实际样品的检测,主要步骤包括：以纯品进行测定;以处理过的空白样品进行测定；回收率的测定; 以水代替空白
6、样品添加标准品测定;以空白样品添加标准品测定;体内实际样品测定。5体内药物分析方法的评价:准确度：回收率-绝对回收率和方法回收率精密度：日内或批内精密度、日间或批间精密度灵敏度：检测限、定量限、最低检测浓度专属性:代谢产物、内源性物质、配伍药物的干扰稳定性：短期室温条件下稳定性考察长期低温条件下稳定性考察冷冻解冻稳定性考察另外对体内药物分析方法的考察还要从分析方法的可靠性、操作的难易、每个样品测定耗费时间、仪器设备要求及成本费用多少进行综合评价第四章 所有适用于体内药物分析的方法简介 第一节、紫外-可见分光光度法:1。VVS的基本原理：物质对不同颜色的光能吸收是有选择性的,特定的物质主要吸收一
7、定波长的光，物质吸收了高能量的光以后,就发生能级跃迁产生吸收光谱.当物质吸收的光的波长在2040nm具有共轭结构的有机复杂的外层电子（价电子)发生能级跃迁并伴随着分子振动和转动能级跃迁，形成紫外吸收光谱。40760m具有较大共轭结构的价电子或有色无机物的价电子发生能级跃迁，并伴随分子振动能级的跃迁形成可见光谱2UVI定量分析的依据：BLbe即朗伯比耳定律：AECL，其中E为吸收系数，在定量分析中尽可能选E值越大的波长处测定以提高测定的灵敏度越好即值越大所能测量的某物质的溶液浓度越小,测定灵敏度越高.3吸收度的加和性:如果溶液中存在两种以上吸光物质时,只要共存物质不互相影响也不改变各自本身的吸收
8、系数,则溶液的吸收度是各组分吸收度的加和，各组分的吸收度由各自的浓度与吸收系数所决定.物质对光的吸收度加和性是测定混合组分的依据。4影响测定准确度的因素：1、偏离Beer定律而引起的误差主要由于仪器和溶液（理化性质)的实际条件与BeerLambet定律的条件不一致而引起;仪器：光源不稳、入射光的谱带宽度不够窄、比色皿的厚度和均匀度不合要求溶液的理化性质：被测物为胶体溶液或浑浊液；被测物的理化性质不稳或溶液浓度改变而使溶质发生解离、缔合导致被测物的组成改变或显色条件控制不好;被测物溶液浓度过大(大于01ol/L）导致工作曲线弯曲.2、透光率测定误差：浓度测量值的相对误差CC=0。44DT/Tlg
9、T,当吸收度值在20.7时浓度测量值的相对误差值较小，为最佳测量范围。在体内药物分析中由于药物浓度较低,吸收度的测量值较小,会在0.0201之间，测量值的相对误差值达2。8%10.3%3、操作不当引起的误差5常用样本处理方法:液液萃取萃取后衍生化固相萃取第二节 气相色谱：。基本原理：以气体（载气）为流动相，由于被测样品中各组分在固定相与载气间的分配系数不同而被分离。各组分将按分配系数大小顺序,依次被载气带出色谱柱,分配系数小的组分先流出；分配系数大的后流出。流出色谱柱的各组分被载气带入检测器。检测器将物质的质量变化转变为电压或电流变化，由记录器记录电压或电流随时间的变化,即色谱的峰高或峰面积。
10、由于色谱的峰高或峰面积与被测物质的含量成正比，可用峰高或峰面积进行定量分析；物质的色谱峰出峰时间与物质本性有关，色谱峰的出峰时间即保留时间进行定性分析.2.主要仪器装置：载气瓶压力调节器净化器稳压阀 柱前压力表转子流量计进样器色谱柱色谱柱恒温箱检测器尾气出口记录器载气由高压气瓶供给，经压力调节器降压,经净化器脱水及净化，由稳压阀调至适宜的流量进入色谱，待流量、温度及基线先定后，即可进样.液态样品用微量注射器吸取，由进样器注入，样品被载气带入色谱柱。气态样品可用六通阀或注射器进样。3.固定液的必备条件：一般为高沸点的液体，室温时为固态和液态（1)在操作温度下呈液体状态及蒸气压低，蒸气压低,固定液
11、流失慢、柱寿命长、检测器本底低（2)对样品中各组分有足够的溶解能力，分配系数较大(3)选择性能高，对两个沸点或性质相近的组分的分配系数比不相等（4）与样品中的各组分不产生化学反应.4.固定液选择的原则:相似性原则:按被分离组分的极性或官能团与固定液相似的原则来选择，相似相溶的缘故被分离药物为非极性的非极性的固定液被分离药物为极性的极性的固定液被分离药物为酯或醇酯、聚酯或醇、聚乙二醇类固定液难分离药物样品按一定比例组成的混合液涂在载体5常用检测器种类：30多种,主要有：ID、FI、 NP、ED、 MD 第三节 高效液相色普法1.基本原理:混合物中各组分在固定相与流动相中的移动速度不同二相互分离。
12、分析HLC的分离分析质量，主要参数如保留值（tR)、相平衡参数(K)、分离度()、理论塔板数（n）。2。保留值:保留值:用来描述样品组分在色谱中保留程度的参数,是色谱的定性指标.可用保留时间、保留体积、调整保留时间和调整保留体积来表示。保留时间（tR ):从进样开始到某组分的色谱峰顶点时时间间隔保留体积(R）:从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大点时所需通过色谱柱的流动体积死时间0：不保留组分（该组分不溶于固定相或不被固定相吸附）的保留时间,相对应的流动相的体积为死体积V0调整保留时间t t t和调整保留体积V RV3,相平衡参数：在色谱洗脱过程中样品分子在流动相和固定相之间分配处于动力学平衡
13、状态，这一平衡可用平衡分配系数和容量因子表示.分离度:定量分析时要求定量峰与其他峰或内标峰有较好的分离度R,一般R1。5，除另有规定。5理论塔板数n(1）色谱柱的理论塔板数n=54(tR/wh2）或=16（t/w)，是柱效指标（2)在选定条件下用供试品溶液或内标物溶液（规定项规定）,测得理论板数n,如果n规定的最小理论板数,应改变柱长、载体性能、色谱柱充填优劣,使达到要求（3） h/越小柱效越高。增加n来提高分离度,即使色谱峰变窄将两相邻峰分开6.梯度洗脱：所谓梯度洗脱，具有两种或两种以上不同极性的溶剂在分离过程中按一定程序连续的改变，以改变流动相的配比和极性。7反相键合相色谱:在反相色谱中流
14、动相得极性大于固定相得极性。洗脱次序为极性大得组分先洗脱,极性小得组分后洗脱固定相-非极性键合相即键合相表面基团为非极性烃基,最常用得为十八烷基键合相(ODS键合相）,但注意键合相的稳定性(pH25)及键合相的重现性流动相:与一般液相色谱用流动相的要求一样.化学稳定性好,不与固定相发生化学反应; 必须与检测器相适应；对样品有适宜的溶解度； 粘度小，因为粘度小的溶剂可增加柱压并影响柱效.最广泛应用的流动相甲醇-水、乙睛-水、四氫呋喃水8。正相键合相色谱：正相键合相色谱中流动相的极性小于固定相的极性.洗脱次序为极性弱的先出峰，极性强的后出峰.正相键合相的分离机理有吸附合分配之分争，吸附过程是主要的
15、相互作用。正相键合相色谱中的固定相为极性键合固定相,主要是氨基、氰基键合相.流动相：正相色谱流动相的选择原则和液固色谱、薄层色谱的洗脱剂的选择大体相同，用非极性和弱极性的溶剂(如烃类溶剂）加入适量的极性溶剂（氯仿、醇、乙睛等，调节控制洗脱液的洗脱强度）。9 离子对色谱：将离子对的液-液提取用于色谱中所形成的方法，即把与离子型化合物带 相反电荷的反离子加到流动相系统,使与被测的组分形成电中性的离子产物而达到分离。这种方法称为离子对色谱，可分为正相离子对色谱和反相离子对色谱.反相离子对色谱在体内药物分析中应用广泛。第四节 高效毛细管电泳法1原理：以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品种各组分之间淌度和分配系数的不同而实现分离的一类液相分离技术2 装置：一个高压电源、一根毛细管、一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。主要分析参数:(1）淌度与迁移时间（2）电泳：荷电物质(离子)在电场中因受到吸引或排斥而引起的差速运动的现象（3）
