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1、实验四 大肠菌群和粪大肠菌的检验一、实验目的要求1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。二、原理 大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般 认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。该 菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生 学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能 性。食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示
2、。三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml 广口瓶1个稀释样品2、500ml 三角瓶2个制生理盐水3、250ml 三角瓶1个制 EMB 琼脂4、18X 180mm 试管8支稀释及制双料乳糖胆盐发酵管5、18X 150mm 试管2025 支单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管6、13X 130mm 试管20 支制蛋白胨水、EC肉汤7、1ml 移液管5支8、10ml 移液管3支9、直径为 90mm 平皿12套制 EMB 平板10、250ml 量筒1支（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把 开瓶器 不锈钢药匙1把 滴管胶头4只 称量纸适量（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1、0.85
3、%NaCl 生理盐水300ml500ml 三角瓶2、乳糖胆盐发酵管双料-：10ml/支5支60ml18X 180mm 试管（装有导管）单料：10ml/8支90ml18X 150mm 试管（装有导管）3、EMB 琼脂：1瓶120ml250ml 三角瓶4、乳糖发酵管：3ml/支5支20ml13X 130mm 试管（装有导管）5、EC肉汤：3 ml/支6支20ml13X 130mm 试管（装有导管）6、蛋白胨水：2ml/支10 支20ml13X 130mm 试管四、实验内容（第一天） 样品处理及初发酵接种： 所需培养基与器材：? 培养基：1. 0.85%NaCl 生理盐水： 300ml1 瓶2. 乳
4、糖胆盐发酵管双料：10ml/支35支18X 180mm试管（有导管）单料：10ml/支68支18X 150mm试管（有导管）? 灭菌器材：12个3支1支5支3支500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠）18X 180mm 试管250ml 量筒1ml 移液管10ml 移液管 当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3 只； 当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。（一）、 样品处理（无菌操作）? 样品：瓶装饮料或酿造酒类： 用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌的开瓶器将盖打开，将含二 氧化碳的样品倒入一信灭菌瓶内，加盖假盖，口勿盖紧，在其上覆
5、盖在一块灭菌纱布，轻轻 摇荡，待气体全部逸出后，妈样进行稀释。? 乳制品：袋装奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口，以无菌操作取样,放入灭菌的三角瓶内，将225mL 温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先用少量生理盐水将奶粉调成糊状，再全部加入，以免结块）。（二）、 检样稀释与乳糖胆盐发酵试验初发酵（无菌操作）1、用无菌量筒量取225mL灭菌生理盐水倒入灭菌玻璃瓶内，用10ml移液管吸取9mL生理 盐水注入无菌试管中，共 2 支，备用。2、以无菌操作将检样25mL（g ）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内 （瓶内置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1： 10的均匀
6、稀释液。固 体检样最好用均质器，以8 00010000r/min的速度处理1min,做成1： 10的均匀稀释液。3、用10ml移液管吸取1： 10的稀释液10ml分别注入双料乳糖胆盐发酵管中：共3支。4、用1ml移液管吸取1 : 10的稀释液1ml分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。5、用同上一支1mL灭菌吸管吸取1 : 10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水的试管 内，换一支吸管，吸吹5 次，或振摇试管混匀，做成1: 100的稀释液。再用这支吸管吸取1 : 100稀释液1mL分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。? 注意：做 10 倍递增稀释时，每递增稀释一次，要换用 1 支 1mL
7、 灭菌吸管。? 放入培养箱培养：将接种后的乳糖胆盐发酵管置361C温箱内，培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管都不 产酸不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产酸产气者（培养液由紫蓝色变成黄色并有气 泡），则按下列程序进行试验。（第二天）进行 EMB 平板分离， EC 肉汤、蛋白胨水接种（粪大肠菌群检验） ：（无菌操作） 所需培养基与器材：捋关甘 培养基1. EMB琼脂平板5只2. EC肉汤：5支3. 蛋白胨水：5 支? 器材：44.50.2C水浴箱，接种环。（一）、接种EMB平板进行分离培养将产气的发酵管分别转种在EMB琼脂平板上（一管对一个平板），置361C温箱内，培 养1824h，然后取出，
8、观察菌落形态，并挑取可疑菌落做：革兰氏染色和证实试验。在 EMB 平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。 由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意 挑选。（二）、接种EC肉汤（用于粪大肠菌群检验）用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内（一管对一个管、，置44.5 0.2C水浴箱内（水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面），培养242h。经培养后，如所有EC 肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于 伊红美蓝琼脂平板上，置361C培养1824h，凡平板上有典型菌落者，则
9、证实为粪大肠 菌群阳性。（三）、 接种蛋白胨水：（用于粪大肠菌群检验） 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于蛋白胨水内（一管对一个管 ），置44.5 0.2C水浴箱内，培养242h。同时取一蛋白胨水培养基不接种，一起培养做对照试验。（第三天）进行乳糖发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验、观察EC肉汤发酵结果 所需培养基与器材：? 培养基：1. 乳糖发酵管： 5 支2. 靛基质试剂、（欧波试剂）3. 革兰氏染色液? 器材：显微镜（一）、 乳糖发酵接种在 EMB 平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光 泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、
10、湿润等，常为大肠杆菌，均应 注意挑选从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个同时接种乳糖发酵管，置361C温箱内培 养242h，观察产气情况。（二）、 进行镜检从 EMB 平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12 个进行革兰氏染色。大肠菌群菌：革兰氏染色 阴性无芽胞短杆菌。（三）、 进行靛基质试验向培养后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基质试剂（欧一波试剂）0.5mL,静置片刻，观察液面。 阳性反应者，液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。则证实为粪大肠菌群阳性。（四）、观察EC肉汤发酵结果如所有EC肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分 别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置3
11、61C培养1824h，凡平板上有典型菌落者，则证实： 为粪大肠菌群阳性。（第四天）观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗（一）、 观察乳糖发酵结果 观察：乳糖发酵管内是否有气体产生? 凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。（二）、 查表报告结果根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN 值。根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）粪大肠菌群的MPN 值。五、思考题1、 大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？2、 为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？3、复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需要加胆盐？4、所有发酵管均为阴性反应时，检验结果可否报告为“零”？
